陳文杰 杭柏林 劉保國 楊洋 劉莉莉 郭佳佳 寧春妹

摘要：為了解鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、抗原性和細胞表位的特性，通過在線工具和軟件分析了鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、二級結(jié)構(gòu)、抗原性、T細胞表位和B細胞表位。結(jié)果表明，鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33為分子質(zhì)量較大、帶正電荷、穩(wěn)定的微疏水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有較好的抗原性，有10條B細胞表位和14條T細胞表位，其中有4條重疊的多肽是B細胞表位和T細胞表位中的優(yōu)勢多肽，有5條交叉重疊的多肽是T細胞表位中的優(yōu)勢多肽。說明鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，優(yōu)勢表位多肽將為抗鴿毛滴蟲的表位疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴿毛滴蟲;黏附蛋白;抗原性;細胞表位;生物信息學(xué)

中圖分類號： S852.72 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0163-04

鴿毛滴蟲（Trichomonas gallinae）是一種可以感染鴿、雞等多種禽類的原蟲，引起鴿的疾病稱為鴿毛滴蟲病（Trichomoniasis）或鴿癀[1-2]。鴿毛滴蟲病呈世界性分布，是鴿子的一種常見病[3]。因在鴿群中常常連綿不斷，造成的經(jīng)濟損失巨大，鴿毛滴蟲病也被認為是鴿子的一種重大疾病[4]。目前，主要通過藥物（中藥和西藥）和生物安全措施進行鴿毛滴蟲病的治療和預(yù)防[5-7]。但是，鴿毛滴蟲的耐藥性蟲株逐漸出現(xiàn)[8]，同時某些西藥如甲硝唑因毒副作用被禁止用于動物[9]。因此，必須尋找新的方法用來預(yù)防鴿毛滴蟲病。疫苗免疫是預(yù)防傳染病最好的方法。目前，還沒有用來預(yù)防鴿毛滴蟲病的商業(yè)性疫苗，但已有全蟲滅活疫苗和重組亞單位疫苗研究的報道[10-11]。羅鋒研究證實，以鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33制備的重組亞單位疫苗具有較好的免疫保護性[11]。

表位疫苗是利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科知識篩選抗原表位，構(gòu)建串聯(lián)表位基因，表達、純化后與某些免疫增強劑聯(lián)合使用的一種疫苗[12]，具有安全性好、成本低等優(yōu)點。本研究利用生物信息學(xué)方法分析了鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性、二級結(jié)構(gòu)、抗原性和細胞表位等特征，對深入研究鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的生物學(xué)功能具有重要意義，并為預(yù)防鴿毛滴蟲病候選疫苗的細胞表位篩選和表位疫苗研究提供候選靶標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33氨基酸序列來自文獻[11]，共有309個氨基酸，其氨基酸序列為MLSSSFERNIHQPLLFIDKDTRVVIQGIGNQGQFHSRLMRQYGTKVVGAVHPKKSGTIIAGLPIFKDMKEVVKKTDANASLIFVPAPGAAQACIDAAKAGMGLVVCITEHIPQHDMIKVKKVMKETGCQLIGPNCPGLIQPGTHTKLGIIPTSIFANGKIGVVSRSGTLTYEAAFATTLAGLGQSTVVGIGGDPFAGQLHTDVVKRFAADPKTEGIILIGEIGGTSEEDAAEWIAKNQLCKEKPVVAFIAGATAPPGKRMGHAGAIVSGGKGTAEGKYKALEAAGVRIARHPGNMGKFIFEEMKRMGKI。

1.2 試驗方法

用DNAStar軟件中的Protean工具分析蛋白的抗原性，用ProtParam工具 （https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的理化特性，用npsa-prabi工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用T cell class I pMHC immunogenicity predictor工具（http：//tools.immuneepitope.org/immunogenicity/）分析蛋白的免疫反應(yīng)能力，用Antibody Epitope Prediction工具（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）分析蛋白的B細胞表位，用CD4 T cell immunogenicity prediction工具（http：//tools.immuneepitope.org/CD4episcore/）分析蛋白的CD4 T細胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的理化特性

通過ProtParam工具分析，可以得到蛋白的一些理化特性。經(jīng)過分析，鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33有309個氨基酸，由20種氨基酸構(gòu)成，分子式為 C1 447H2 356N404O413S15，有25個帶負電荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]，有37個帶正電荷的氨基酸[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）];分子質(zhì)量為32 501.98 u，等電點（pI）為9.5;預(yù)測的半衰期：30 h（哺乳動物網(wǎng)狀細胞，體外），>20 h（酵母，體內(nèi)），>10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）;不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為23.52，表明AP33蛋白為穩(wěn)定蛋白;脂肪性指數(shù)為89.39，GRAVY指數(shù)為0.031，表明AP33蛋白為微疏水性蛋白。

2.2 鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的二級結(jié)構(gòu)

通過SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION方法（構(gòu)象狀態(tài)為4，相似度閾值為8，視窗寬度為17）進行分析，可以預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。如圖1所示，AP33蛋白的氨基酸序列中有100個氨基酸參與了α螺旋，占比32.36%;66個氨基酸參與了延伸鏈，占比21.36%;36個氨基酸參與了β轉(zhuǎn)角，占比11.65%;107個氨基酸參與了隨機卷曲，占比34.63%。這表明鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33有著復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。

2.3 抗原性分析

本研究對鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33進行了理化特性、抗原性和細胞表位的初步分析，為深入研究鴿毛滴蟲黏附蛋白AP33的功能提供了參考依據(jù)，為鴿毛滴蟲表位疫苗的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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