幾丁質(zhì)(Chitin)又名甲殼素，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物的外殼中，是蝦、蟹等甲殼動物可食用部分外的主要廢棄物，自然界每年的產(chǎn)量估計約100億t，是我國近海海域主要的有機污染源之一，同時又是一種用之不竭的生物資源。幾丁質(zhì)被譽為人體所必需的第六生命要素，其衍生物低分子量幾丁寡糖因具有多種生物活性，可用于治療艾滋病、癌癥及心血管疾病，在口腔醫(yī)學(xué)和人體保健等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用[1，2]。幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌是一類能利用幾丁質(zhì)作為碳源而生存、繁殖的特殊的微生物群體，它能通過分泌幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖、幾丁二糖直至幾丁單糖，直接被人體吸收利用，從而使幾丁質(zhì)用途更加廣泛。茂名是一個海濱城市，蝦、蟹資源非常豐富，蝦、蟹殼等廢棄物一直影響著茂名地區(qū)的生態(tài)環(huán)境。作者在此篩選了一株幾丁質(zhì)酶活力高的菌株并對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，擬為 “漁業(yè)垃圾”蝦、蟹等甲殼動物的外殼的再生利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 土樣及試劑

5份土樣采自茂名沿海地區(qū)。

幾丁質(zhì)粉，上海市生物制品有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基(g·L-1):膠體幾丁質(zhì)5，K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂 15，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基，g·L-1):蛋白胨10，酵母膏 5，氯化鈉10，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：細粉幾丁質(zhì)5，蛋白胨10， K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01， pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

1.3 膠體幾丁質(zhì)的制備

稱取10 g幾丁質(zhì)粉末，加入40 mL丙酮，充分研磨至糊狀。在低溫下邊研磨邊慢慢加入濃鹽酸400 mL，幾分鐘后，用玻璃棉過濾，在劇烈攪拌下將濾液緩緩加入到劇烈攪拌的50%乙醇(至少是濾液的5 BV以上)中，使膠體幾丁質(zhì)沉淀析出，離心收集膠體幾丁質(zhì)，用蒸餾水沖洗幾次，置透析袋過夜,避光保存在冰箱中。

1.4 菌種篩選方法

采用平板稀釋法。取土樣1 g，用無菌水以10倍梯度稀釋成10-1～ 10-6稀釋液，取10-4～10-6稀釋液0.1 mL涂幾丁質(zhì)平板，在30℃下培養(yǎng)3～5 d。挑取產(chǎn)透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌株純化培養(yǎng)并保存待用。

按照常規(guī)細菌學(xué)方法[3]鑒定到屬。

1.5 產(chǎn)酶條件實驗方法

取30 mL種子培養(yǎng)基置于 250 mL三角瓶中，接入1～2環(huán)斜面菌種，30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d作為種子。以2%接種量接入各個實驗的培養(yǎng)基中，除另有說明外，產(chǎn)酶實驗條件均為30℃、180 r·min-1培養(yǎng)72 h，每一實驗3次平行。發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過4層紗布過濾，再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測定酶活力。

采用L9(34)正交實驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件，正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素和水平

1.6 酶活力測定方法

酶活力測定用DNS法[4,5]。取1 mL發(fā)酵上清液加入1 mL含1%膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖溶液(pH值7.0)，50℃保溫 1 h，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑中止反應(yīng)，沸水浴5 min，冰浴冷卻，離心后取上清

液通過紫外分光光度計在波長200～700 nm范圍內(nèi)全波掃描，得到最大吸收波長為470 nm。以不含膠體幾丁質(zhì)的上清液為對照，測吸光度，根據(jù)標準曲線計算產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖 (NAG)的量。

酶活單位定義：在特定條件下，每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與初步鑒定

實驗分離得到4株產(chǎn)透明圈較大的菌株，選取產(chǎn)生透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩(wěn)定的一株命名為X，其菌落圓形，淡黃色，不透明，中央凸起，邊緣整齊(圖1a)。在顯微鏡下觀察，該菌為短桿狀，長0.7～1.0 μm，無鞭毛(圖1b)，該菌的芽孢形態(tài)為圓形或卵圓形(圖1c)。

圖1 菌株X的菌落形態(tài)和透明圈(a)、顯微鏡下的形態(tài)(b)、芽孢在顯微鏡下的形態(tài)(c)

菌株X的生理生化特征見表2。

表2 菌株X 的生理生化特征

綜合圖1、表1結(jié)果可知，菌體直桿狀，革蘭氏陽性，長0.7～1.0 μm，無鞭毛不可運動，好氧型，菌落形態(tài)為圓形，淡黃色，不透明，菌落邊緣整齊，中間隆起，接觸性酶反應(yīng)陰性，V-P和甲基紅試驗呈陰性，有芽孢及營養(yǎng)體。糖酵解反應(yīng)中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，符合短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida,Agri,1996)[3]的一般特征。

2.2 培養(yǎng)時間對菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24 h開始，每隔12 h取樣品測酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)時間對菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，菌株X產(chǎn)酶活性在培養(yǎng)72 h 時達到最大值，此后隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活迅速下降。后續(xù)實驗均培養(yǎng)至72 h測定酶活。

2.3 溫度對菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在25℃、30℃、35℃、40℃下培養(yǎng)72 h，測酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，菌株X在30～35℃溫度范圍內(nèi)產(chǎn)酶活性較高，且較穩(wěn)定。最適產(chǎn)酶溫度在30℃，酶活達1.02 U·mL-1，在40℃時菌株產(chǎn)酶活性最低。表明菌株X較適宜在低溫環(huán)境中產(chǎn)酶，過高的溫度會抑制其產(chǎn)酶活性。

2.4 初始pH值對菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測酶活,結(jié)果見圖4。

圖4 初始pH值對菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，菌株X在初始pH值為7.0時產(chǎn)酶活性達到最大，酶活達1.08 U·mL-1，其次是pH值為8.0，表明菌株比較適合在弱堿性環(huán)境中產(chǎn)酶，這與許多文獻報道相一致[6，7]。pH值為4.0時產(chǎn)酶活性最低，可能是因為pH值過低會抑制菌株的產(chǎn)酶活性。

2.5 氮源對菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于以細粉幾丁質(zhì)為唯一碳源，分別以2%蛋白胨、2%牛肉膏、2%硫酸銨、2%硝酸銨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測酶活，結(jié)果見圖5。

圖5 氮源對菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，菌株X在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶情況最好，酶活達1.10 U·mL-1。其次是牛肉膏。以硫酸銨、硝酸銨為氮源時產(chǎn)酶較差，說明菌株X在有機氮源中易產(chǎn)酶，特別是對蛋白胨的利用率最高，卻不能較好地利用無機氮源。

2.6 碳源對菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于以蛋白胨為唯一氮源，分別以2%細粉幾丁質(zhì)、2%膠體幾丁質(zhì)、2%葡萄糖、2%淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 碳源對菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖6可知,菌株X在不同碳源的培養(yǎng)基中均可產(chǎn)酶，以細粉幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)為碳源時產(chǎn)酶較好，其中以細粉幾丁質(zhì)為碳源時最好，酶活達1.08 U·mL-1，而以葡萄糖和淀粉為碳源時產(chǎn)酶效果較差。這可能是因為細粉幾丁質(zhì)或膠體幾丁質(zhì)可作為菌株生長所需的碳源。說明該菌株所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶為一種誘導(dǎo)酶，幾丁質(zhì)或其衍生物可以充當(dāng)誘導(dǎo)物[8]。而葡萄糖可能有阻遏作用。

2.7 菌株X產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

在單因素優(yōu)化實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了L9(34)正交實驗對最佳產(chǎn)酶碳源(細粉幾丁質(zhì))、氮源(蛋白胨)、初始pH值和溫度之間的交互作用做了進一步的研究。正交實驗的結(jié)果與分析見表3。

表3 正交實驗結(jié)果與分析

由表3可以看出，各因素對產(chǎn)酶影響大小依次為D>C>A>B,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值?？赡苁怯捎谔荚?、氮源都是菌株產(chǎn)酶所必需的物質(zhì)，所以影響最大。菌株X的最適產(chǎn)酶組合為A1B2C1D2，即溫度為30℃、pH值為7.0、細粉幾丁質(zhì)10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。

2.8 優(yōu)化條件下菌株X的產(chǎn)酶活性

取培養(yǎng)2 d的菌種的種子培養(yǎng)液，按2%的接種量接入以10 g·L-1細粉幾丁質(zhì)為唯一碳源、10 g·L-1蛋白胨為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液中，在pH值7.0、30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過4層紗布過濾再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測得酶活為1.24 U·mL-1、1.25 U·mL-1、1.25 U·mL-1，平均酶活約1.25 U·mL-1，比條件優(yōu)化前有較大提高。

3 結(jié)論

(1)通過平板透明圈法初篩、復(fù)篩，從土壤中獲得一株透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩(wěn)定的菌株X。根據(jù)菌株和菌落的形態(tài)以及生理生化特征，初步判斷該菌為短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida.Agri)。

(2)菌株X培養(yǎng)72 h 時產(chǎn)酶達高峰。單因素實驗和正交實驗表明，各因素對產(chǎn)酶的影響大小依次為碳源>氮源>溫度>pH值,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值。菌株X產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳條件為：溫度30℃、pH值7.0、細粉幾丁質(zhì)10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。在此優(yōu)化條件下幾丁質(zhì)酶活達1.25 U·mL-1。

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