龔福明，何彩梅，唐小艷，柳陳堅(jiān)*

（1.德宏職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，云南芒市678400；2.賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；3.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀

龔福明1，何彩梅2，唐小艷1，柳陳堅(jiān)3*

（1.德宏職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，云南芒市678400；2.賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；3.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

幾丁質(zhì)酶（chitinase）是一類可催化幾丁質(zhì)水解為N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體或單體的糖苷水解酶，廣泛存在于微生物（真菌、細(xì)菌、放線菌與病毒）及動(dòng)植物中，因其特殊的生理功能而被廣泛應(yīng)用于生物防治、醫(yī)學(xué)應(yīng)用、廢棄物處理及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。文章綜述了微生物幾丁質(zhì)酶的來(lái)源與分類、發(fā)酵條件、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域，以期為幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

幾丁質(zhì)；微生物幾丁質(zhì)酶；發(fā)酵條件；酶學(xué)性質(zhì)；應(yīng)用

幾丁質(zhì)（chitin）也稱為甲殼質(zhì)，是一種由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的直鏈高分子生物多聚體，是含量?jī)H次于纖維素的第二大天然多聚物[1]。相關(guān)報(bào)道表明，幾丁質(zhì)是甲殼類動(dòng)物、昆蟲(chóng)、真菌及線蟲(chóng)等病原生物體壁結(jié)構(gòu)上的重要組成[2]，對(duì)機(jī)體具有支持與保護(hù)作用。幾丁質(zhì)在甲殼類動(dòng)物外殼中的含量極高（可高達(dá)85%），當(dāng)其與鈣鹽及蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)變成堅(jiān)硬的外殼，用酸堿處理甲殼類動(dòng)物外殼脫去鈣鹽和蛋白質(zhì)后，加熱即可制備可溶性殼聚糖，因而也被俗稱為甲殼素。

幾丁質(zhì)酶（chitinase）EC3.2.1.1 4是BENECKE U[3]在1905年研究幾丁質(zhì)芽孢扦菌（Bacillus chitinovrous）分解幾丁質(zhì)的過(guò)程中，首次分離發(fā)現(xiàn)的一類可催化幾丁質(zhì)水解并將之徹底水解為N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體或單體的糖苷水解酶，分屬于18和19兩個(gè)家族，而微生物幾丁質(zhì)酶大多歸屬于18家族[4]。隨著研究深入與繼續(xù)，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶除廣布于真菌、細(xì)菌及放線菌等微生物中外，還大量存在于昆蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物、高等植物甚至病毒中[5]。相關(guān)研究表明，幾丁質(zhì)酶是生物體內(nèi)降解或利用幾丁質(zhì)的關(guān)鍵，一方面幾丁質(zhì)酶能通過(guò)水解病原真菌細(xì)胞壁，破壞害蟲(chóng)體壁及殺蟲(chóng)增效等機(jī)制發(fā)揮生物防治作用，另一方面幾丁質(zhì)酶還能通過(guò)催化幾丁質(zhì)水解，促進(jìn)其自然界循環(huán)的作用，維持生態(tài)系統(tǒng)平衡[4-5]。又因幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解后的N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體或單體等產(chǎn)物的抗菌，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等特性，使幾丁質(zhì)酶被大量用于環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品加工等領(lǐng)域并表現(xiàn)出巨大的市場(chǎng)潛力[6-7]。

正是基于巨大的市場(chǎng)潛力和應(yīng)用價(jià)值，幾丁質(zhì)酶制備及其研發(fā)并日益受人們重視。與其他幾丁質(zhì)酶來(lái)源相比，微生物幾丁質(zhì)酶具備生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、可通過(guò)發(fā)酵法制備，操作性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益良好等優(yōu)勢(shì)[8]，加之近年來(lái)微生物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特性、產(chǎn)酶條件及基因克隆與表達(dá)等研究與日俱增，微生物幾丁質(zhì)酶逐漸成為研究新熱點(diǎn)。本文對(duì)微生物幾丁質(zhì)酶的來(lái)源與分類、發(fā)酵條件、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域等內(nèi)容進(jìn)行綜述，以期為微生物幾丁質(zhì)酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供論指導(dǎo)與參考。

1 微生物幾丁質(zhì)酶的來(lái)源

繼BENECKE U于1905年首次從幾丁質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus chitinovrous）中發(fā)現(xiàn)并分離微生物幾丁質(zhì)酶后，各國(guó)學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、放線菌、真菌，甚至病毒等分屬46個(gè)屬近70個(gè)種的微生物均能分泌幾丁質(zhì)酶（見(jiàn)表1）[4，9]。此外，海洋微生物也蘊(yùn)藏著巨大的潛力，諸如珊瑚、嗜冷菌（Moritellamarina）、海洋鏈霉菌（Streptomycesolivaceus）FXJ7.023、白孢鏈霉菌（Streptomycesalbosporeus）及蜂房芽孢桿菌（Bacilluspluton）等海洋微生物都表現(xiàn)出極強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶分泌能力[10-12]。而芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）中的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）及枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）等更是目前研究運(yùn)用比較多的幾丁質(zhì)酶來(lái)源微生物；堅(jiān)信隨著研究深入，大量的微生物幾丁質(zhì)酶將被運(yùn)用到環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及食品加工等領(lǐng)域。

表1 常見(jiàn)幾丁質(zhì)酶來(lái)源微生物Table 1 Microorganism s of sources of common chitinase

2 微生物幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵條件

幾丁質(zhì)酶來(lái)源微生物類群很多，涵蓋了46個(gè)屬近70個(gè)種，菌種及菌株差異會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵制備幾丁質(zhì)酶的條件各不相同，但大多微生物幾丁質(zhì)酶都是誘導(dǎo)酶，只在幾丁質(zhì)或幾丁質(zhì)衍生物等底物誘導(dǎo)下才合成可分泌到胞外的幾丁質(zhì)酶[13]。此外，微生物發(fā)酵分泌幾丁質(zhì)酶時(shí)易受碳氮源種類，溫度、pH值、金屬離子及有機(jī)溶劑等因素影響。相關(guān)研究證實(shí)，微生物法制備幾丁質(zhì)酶的最適溫度一般在28～30℃，最適pH值介于5.0～9.0之間，底物濃度一般為1.5%～2.0%，單糖葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）與阿洛氨菌素（allosam idin）等化合物對(duì)產(chǎn)酶有阻遏作用，金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性也有較大影響，但上述影響因素在作用時(shí)存在明顯菌株差異[13-14]。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，不同菌株在發(fā)酵條件及抑制因素等方面也存在較大差異。郝之奎等[15]在慢生根瘤菌科芽生桿菌屬（Bradyrhizobiaceaeblastobacter）菌株SYBC-H2發(fā)酵分泌幾丁質(zhì)酶的研究中證實(shí)，幾丁質(zhì)是誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶合成并分泌的關(guān)鍵，玉米漿與幾丁質(zhì)的產(chǎn)酶交互作用較好，能有效提高酶活性（5.70 U/m L），而葡萄糖與幾丁質(zhì)的交互作用不明顯，在一定程度上起抑制作用。RISHAD K S等[16]在短小芽孢桿菌（Bacilluspum ilus）MCB-7產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件優(yōu)化過(guò)程中證實(shí)，碳氮源種類、溫度、pH值、金屬離子及有機(jī)溶劑等因素均能影響該菌株的酶產(chǎn)量與活性，而幾丁質(zhì)、蛋白胨及發(fā)酵液pH值是決定酶產(chǎn)量及活性的關(guān)鍵，經(jīng)Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化后，菌株B.pum ilus MCB-7的酶活達(dá)23.19 U/m L，比未優(yōu)化前（3.36 U/m L）提高近7倍。另外，誘變育種也是提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量及活性的有效途徑，胡基華等[17]通過(guò)NaNO2、紫外和復(fù)合誘變等方法對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）S68進(jìn)行誘變育種并分離到高活性突變株CM 5，與原始菌株相比其幾丁質(zhì)酶活性提高了4.3倍。相關(guān)研究表明[18，26]，Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+等金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有促進(jìn)作用，而Hg2+、Ag2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Co2+及Pb2+等金屬離子對(duì)酶活卻起到抑制作用，但存在菌株差異。Mg2+和Ca2+能有效提升芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）菌株R2由來(lái)幾丁質(zhì)酶活性，而能有效提高氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）由來(lái)幾丁質(zhì)酶活性的金屬離子則是Mn2+和Mg2+，重金屬離子Hg2+、Ag2+及Pb2+等對(duì)上述菌株由來(lái)幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用極強(qiáng)。此外，相關(guān)報(bào)道表明菌種及菌株差異也會(huì)影響幾丁質(zhì)酶活性，SUZUKIS等[19]在用幾丁質(zhì)酶18家族抑制劑阿洛氨菌素對(duì)6株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）細(xì)菌的產(chǎn)酶抑制研究中發(fā)現(xiàn)，大多18家族的微生物幾丁質(zhì)酶會(huì)被阿洛氨菌素抑制，但鏈霉菌屬的實(shí)驗(yàn)菌株因含chi65基因而未被抑制。

3 微生物幾丁質(zhì)酶的分離純化

為開(kāi)發(fā)微生物幾丁質(zhì)酶潛在的市場(chǎng)價(jià)值，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化及規(guī)?；a(chǎn)，探索快速而有效的制備與分離純化體系就成了微生物幾丁質(zhì)酶開(kāi)發(fā)運(yùn)用的關(guān)鍵。目前，微生物幾丁質(zhì)酶常用的分離純化方法有超濾、離心、鹽析、層析凝膠過(guò)濾及電泳等方法，為盡量降低酶活損失，提高純度及回收率，在分離純化時(shí)往往會(huì)綜合考慮運(yùn)用上述分離純化方法。即首先用鹽析等方法對(duì)粗酶液進(jìn)行濃縮，然后再用DEAE纖維素層析及葡聚糖凝膠（Sephadex G-100柱）層析等方法純化粗酶，最后經(jīng)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）分離即可得到純度高且活性較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶。KARTHIK N等[20]首先用60%（NH4）2SO4沉淀法濃縮幾丁質(zhì)酶粗酶液，接著依次用DEAE陰離子交換層析及高分子凝膠滲透層析法純化粗酶，用SDS-PAGE分離初步純化的幾丁質(zhì)酶，然后再用上述兩種層析法進(jìn)一步純化，并最終通過(guò)幾丁質(zhì)酶譜法與等電點(diǎn)測(cè)定相結(jié)合的體系，分離到鏈霉菌（Streptomyces sp.）由來(lái)且具有抗真菌活性的酸性幾丁質(zhì)酶。后續(xù)研究表明，該酶分子質(zhì)量為40 ku，在溫度為50℃時(shí)，該酶在pH值2～10范圍內(nèi)均表現(xiàn)出活性，pH值2～6的酸性環(huán)境中酶活最高（61.3U/mg）且能在室溫下長(zhǎng)時(shí)間維持活性并表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗真菌活性[20]。

4 微生物幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

4.1 微生物幾丁質(zhì)酶的分類

微生物幾丁質(zhì)酶來(lái)源廣泛，加之粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）QMB1466等產(chǎn)酶菌株能同時(shí)產(chǎn)生多種分子質(zhì)量不同的幾丁質(zhì)酶（21 ku、36 ku、48 ku、52 ku及57 ku）[21]，因而微生物幾丁質(zhì)酶種類繁多，但仍能根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，作用位點(diǎn)，最適pH值等特性將之分類。（1）根據(jù)微生物幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的同源性差異，可將微生物來(lái)源幾丁質(zhì)酶分為糖苷水解酶18和19家族，而微生物幾丁質(zhì)酶大多屬于18家族[22]。（2）按微生物幾丁質(zhì)酶對(duì)底物寡糖鏈酶切方式及終產(chǎn)物差異可分為外切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[23]；外切幾丁質(zhì)酶能與底物非還原端結(jié)合，然后依次切開(kāi)糖苷鍵得到單糖；內(nèi)切幾丁質(zhì)酶則與底物隨機(jī)結(jié)合并切開(kāi)相應(yīng)糖苷鍵，得到幾丁寡糖和幾丁二糖。（3）根據(jù)微生物幾丁質(zhì)酶催化反應(yīng)最適pH值不同，可將其分為酸性、中性和堿性幾丁質(zhì)酶，但大多微生物幾丁質(zhì)酶是酸性酶[24]。（4）根據(jù)微生物幾丁質(zhì)酶分泌性質(zhì)不同，可將之分為胞外酶與胞內(nèi)酶，大部分微生物都能產(chǎn)生胞外酶，又因胞外酶較容易提取制備，所以目前研究和應(yīng)用較多的微生物幾丁質(zhì)酶均屬于胞外酶。

4.2 微生物幾丁質(zhì)酶的理化性質(zhì)

微生物幾丁質(zhì)酶是一大類復(fù)雜多樣的糖苷水解酶，分子質(zhì)量介于10～100 ku之間，具有活性且較穩(wěn)定的pH值介于3～10之間，最適pH值大多介于4～7之間，等電點(diǎn)（isoelectric point，p I）介于3.6～8.6之間，在4～60℃范圍內(nèi)均有活性，而40～50℃是酶活最高的溫度區(qū)間（見(jiàn)表2），低溫較穩(wěn)定，-20℃凍存兩年以上仍能保持較高活性[25-26]。此外，微生物幾丁質(zhì)酶活性還易受金屬離子、化學(xué)試劑、有機(jī)溶劑及培養(yǎng)時(shí)間等因素影響。CHEBA BA等[27]發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）R2來(lái)源幾丁質(zhì)酶的分子質(zhì)量為41.68 ku，最適溫度為40℃，pH值7.5，Mg2+、Ca2+及1%SDS等因素能有效提升其活性，而Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ag+、Hg2+及化學(xué)試劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA），N-乙酰葡萄糖胺和有機(jī)溶劑乙醇及丙酮等則能抑制其活性。

表2 部分微生物幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of some m icrobial chitinase

4.3 微生物幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)研究

4.3.1 微生物幾丁質(zhì)酶多樣性

微生物幾丁質(zhì)酶大多屬于誘導(dǎo)酶，為利用環(huán)境中幾丁質(zhì)，微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化進(jìn)程中逐漸形成了分解利用環(huán)境中不同衍生類型幾丁質(zhì)的酶，因而幾丁質(zhì)酶的類型及編碼基因會(huì)隨菌種及菌株差異而發(fā)生變化，甚至同一菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也存在顯著差異。TAKESHIT等[28]在分析耕地土壤微生物幾丁質(zhì)酶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤類型及其pH值是決定土壤微生物幾丁質(zhì)酶基因類型和種類的關(guān)鍵，根據(jù)其預(yù)測(cè)的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，501個(gè)耕地土壤微生物幾丁質(zhì)酶被分為9個(gè)類群，與現(xiàn)有已知幾丁質(zhì)酶比較，差異顯著，同源性僅介于40%～70%之間。粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）MB1466的5種幾丁質(zhì)酶由不同基因編碼及橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis）ATCC 11238可由相同基因編碼的前體酶蛋白經(jīng)不同方式剪切形成同源性小，差異較大的5種幾丁質(zhì)酶則進(jìn)一步說(shuō)明微生物幾丁質(zhì)酶的多樣性[21，29]。

4.3.2 微生物幾丁質(zhì)酶的基因結(jié)構(gòu)

幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理與生態(tài)學(xué)意義是現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)之一，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，人們開(kāi)始從微觀領(lǐng)域來(lái)闡明幾丁質(zhì)酶在各應(yīng)用領(lǐng)域的分子機(jī)理及生態(tài)學(xué)意義。一般說(shuō)來(lái)微生物幾丁質(zhì)酶從氨基端到羧基端依次含有決定幾丁質(zhì)酶是否分泌到胞外的信號(hào)肽（signalpeptide，SP），起真正催化水解作用的幾丁質(zhì)酶催化域（catalytic domain，CHC），與幾丁質(zhì)結(jié)合并顯著提升催化效率的幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin binding domain，CBD）及一個(gè)位于C末端可能與分泌相關(guān)的插入序列[30]。但產(chǎn)酶微生物種類及菌株差異會(huì)導(dǎo)致微生物幾丁質(zhì)酶及其結(jié)構(gòu)域存在一定差異，如埃博拉病毒、丙型肝炎病毒及登革熱病毒等病毒不具備完整幾丁質(zhì)酶但含有幾丁質(zhì)結(jié)合域并參與致病[4]，哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）由來(lái)幾丁質(zhì)酶則主要包含了N-末端信號(hào)肽（SP），由137個(gè)氨基酸殘基組成，富含β折疊股的幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChBDVhChiA），428個(gè)氨基酸殘基折疊成含（α/β）8復(fù)雜結(jié)構(gòu)的提姆-桶（TIM-barrel）催化域（catalytic domain，CatD）及由86個(gè)氨基酸殘基折疊成的較短且可區(qū)分幾丁質(zhì)酶不同亞類的（α+β）-折疊插入域（α+β-fold insertion domain）等四個(gè)區(qū)域（見(jiàn)圖1）[31]。FERRANDON S等[32]在研究環(huán)狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）由來(lái)幾丁質(zhì)酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)結(jié)合域中含有高度保守的色氨酸和脯氨酸（Trp687，Pro689，Pro693），其中687位的色氨酸（Trp687）是該結(jié)構(gòu)域的活性中心；位于幾丁質(zhì)酶催化域表面的色氨酸（Trp122，Trp134）是引導(dǎo)幾丁質(zhì)進(jìn)入催化活性中心裂隙的功能位點(diǎn)，而天冬胺酸和谷氨酸（Asp200，Glu204）是催化域中催化水解幾丁質(zhì)的活性中心；而相關(guān)研究表明纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域（FnⅢ）在部分產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌中可能跟致病性相關(guān)[4]。

圖1 哈維氏弧菌幾丁質(zhì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Prim ary structure of chitinase from Vibrio harveyi

4.3.3 微生物幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控

除蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等少數(shù)種屬菌株的幾丁質(zhì)酶表達(dá)兼具組成型和誘導(dǎo)型特點(diǎn)外，微生物幾丁質(zhì)酶大多屬于誘導(dǎo)酶，當(dāng)外界環(huán)境中存在誘導(dǎo)底物時(shí)，幾丁質(zhì)酶合成微生物能經(jīng)過(guò)N-乙酰葡糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（N-acetylglucosamine phosphotransferase system，PTS），三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子（ATP-binding cassette，ABC）及主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NagP等轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物幾丁寡糖或單體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部，產(chǎn)生特定信號(hào)調(diào)控幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，因而微生物幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控可從轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和基因表達(dá)兩個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控[33-34]。

COLSON S等[33]在研究菌株天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）幾丁質(zhì)酶基因調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)，幾丁二糖被ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，但ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)會(huì)受到全局性調(diào)節(jié)因子DasR的阻遏調(diào)控；當(dāng)幾丁單糖被PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DasA則能通過(guò)與雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)ChiS/ChiR中的感受器ChiS外部結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)。糖催化特異性蛋白酶Ⅱ（EⅡ）是大腸桿菌PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的關(guān)鍵，因?yàn)椴徽撌寝D(zhuǎn)運(yùn)幾丁單糖PTS系統(tǒng)中編碼EⅡ的nagE-BACD操縱子，還是轉(zhuǎn)運(yùn)幾丁二糖PTS系統(tǒng)中編碼EⅡ的chb-BCARFG操縱子均受調(diào)節(jié)因子NagC和cAMP受體蛋白-降解物激活蛋白（catabolite activator proteins，CAP）的調(diào)控，而chb操縱子還會(huì)受到自身基因chb-R產(chǎn)物ChbR的調(diào)控，當(dāng)NagC及ChbR與相應(yīng)操縱位點(diǎn)結(jié)合后可起到阻遏作用，而cAMP/CAP則可增強(qiáng)阻遏作用，進(jìn)一步抑制PTS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)；此時(shí)，一旦受到6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的誘導(dǎo)，該阻遏作用就會(huì)消除[35]。

5 微生物幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用

隨著研究深入，微生物幾丁質(zhì)酶在生產(chǎn)及生活中的應(yīng)用越來(lái)越受關(guān)注，加之其來(lái)源廣，易培養(yǎng)等特性，使微生物幾丁質(zhì)酶被廣泛運(yùn)用在生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及食品加工等領(lǐng)域[16]。

5.1 微生物幾丁質(zhì)酶的生物防控作用

微生物幾丁質(zhì)酶生物防控作用主要體現(xiàn)在植物真菌及害蟲(chóng)性病害與蚊媒傳播人畜共患病的預(yù)防等方面。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)木霉菌由來(lái)幾丁質(zhì)酶對(duì)根霉等真菌細(xì)胞壁有降解作用，植物真菌感染及害蟲(chóng)性病害與蚊媒傳播人畜共患病防治時(shí)，則因微生物幾丁質(zhì)酶對(duì)殺蟲(chóng)劑的增效作用而得到有效控制。KOBAYASHID Y等[36]成功證實(shí)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）34S1由來(lái)幾丁質(zhì)酶是生物防治真菌感染導(dǎo)致草坪夏季斑枯病的關(guān)鍵。此外，SEODJ等[37]在類芽孢桿菌（Paenibacillusehimensis）MA2012由來(lái)幾丁質(zhì)酶體外抗真菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，初步純化的類芽孢桿菌MA2012的幾丁質(zhì)酶對(duì)引起經(jīng)濟(jì)林果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）的孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用，其抑制率可高達(dá)87%以上。而蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）IPS78和蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種（Bacillus thuringiensis subsp.aizawai）HD133由來(lái)幾丁質(zhì)酶則能通過(guò)破壞蟲(chóng)體內(nèi)富含幾丁質(zhì)且起到抵御細(xì)菌和病毒入侵屏障-腸圍食膜的機(jī)制，發(fā)揮殺蟲(chóng)增效作用，從而達(dá)到防治植物?；页嵋苟昙靶〔硕旰οx(chóng)，預(yù)防及控制埃及伊蚊所致蚊媒傳播人畜共患病的目的[38]。

5.2 微生物幾丁質(zhì)酶及分解產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

微生物幾丁質(zhì)酶與抗真菌藥物聯(lián)用，可預(yù)防不同類型真菌感染，而幾丁質(zhì)經(jīng)幾丁質(zhì)酶降解后的N-乙酰幾丁寡糖和殼聚幾丁寡糖等產(chǎn)物具備抗腫瘤、抗感染及防治瘧疾等多種生理功能[39]。幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物幾丁六糖和殼六糖在ddY鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，注射劑量為100mg/（kg·d），連續(xù)注射3次后，幾丁六糖和殼六糖對(duì)S180肉瘤的抑制率可達(dá)85%和93%，注射5次后幾乎可完全抑制腫瘤生長(zhǎng)[40]；而幾丁六糖則在促進(jìn)BALB/C鼠PEC（腹膜腔滲出細(xì)胞）活性氧生成，增強(qiáng)殺菌作用，發(fā)揮抗感染方面表現(xiàn)出巨大潛力[41]。REBECCA C L等[42]通過(guò)敲除惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falcarum）幾丁質(zhì)酶基因（PbCHT1）的研究證實(shí)，幾丁質(zhì)酶是惡性瘧原蟲(chóng)感染按蚊中腸的關(guān)鍵，針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶PbCHT1表面抗原決定簇的單克隆抗體1C3能有效抑制瘧原蟲(chóng)對(duì)按蚊的侵染，從而利于控制瘧疾的傳播與感染。另外，人體腸道正常菌群也具有分泌幾丁質(zhì)酶，并通過(guò)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰幾丁寡糖和殼聚幾丁寡糖等降解產(chǎn)物的機(jī)制，發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)及增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能[43]。

5.3 微生物幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)廢棄物處理上的應(yīng)用

在日常生活及工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生蟹殼、蝦殼等大量幾丁質(zhì)廢棄物，這些廢棄物會(huì)對(duì)水體等自然環(huán)境造成嚴(yán)重污染，為提高廢棄物利用率，防止水體等環(huán)境被污染，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物就被大量用于幾丁質(zhì)廢棄物處理[39]。相關(guān)報(bào)道表明，幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物N-乙酰幾丁寡糖和殼聚幾丁寡糖等產(chǎn)物是良好的膳食纖維，有甜味適宜，吸濕性及保濕性強(qiáng)，能有效改善食品風(fēng)味及品質(zhì)，提升營(yíng)養(yǎng)等特性；加之幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物氨基糖寡糖素具有調(diào)節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞代謝的特性，使微生物幾丁質(zhì)酶在處理幾丁質(zhì)廢棄物，提升食品、化妝品及飼料品質(zhì)方面有巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[2]。而粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）等幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌已被廣泛用于以蟹殼等幾丁質(zhì)廢棄物為原料，分解制備高經(jīng)濟(jì)價(jià)值單細(xì)胞蛋白的食品工業(yè)，并表現(xiàn)出巨大的市場(chǎng)潛力[21]。

5.4 微生物幾丁質(zhì)酶在其他方面的應(yīng)用

隨著研究深入，幾丁質(zhì)酶除上述幾個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域外，幾丁質(zhì)酶在基因工程、真菌性原生質(zhì)體制備及提升菌株生物技術(shù)應(yīng)用等領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。相關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)入并成功表達(dá)微生物相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗真菌感染能力與預(yù)防線蟲(chóng)及昆蟲(chóng)性病害的特性[39]，幾丁質(zhì)酶在作用于黑曲霉（Aspergillusniger）細(xì)胞壁后，能有效從黑曲霉培養(yǎng)液中制備丹寧酸酶（反膠團(tuán)萃取該酶回收率可高達(dá)43%）[44]，而去除細(xì)胞壁的真菌原生質(zhì)體則被廣泛用于真菌細(xì)胞壁合成機(jī)理，酶合成分泌機(jī)理及生物技術(shù)應(yīng)用方面的探究[45]。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，微生物幾丁質(zhì)酶是一類具有廣闊應(yīng)用前景的新型生物酶，能有效用于生物防治，醫(yī)學(xué)應(yīng)用，廢棄物處理，環(huán)境保護(hù)及食品加工等領(lǐng)域?，F(xiàn)階段微生物幾丁質(zhì)酶的研究多集中在菌種選育及產(chǎn)酶條件等方面，加之幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)理復(fù)雜，自然分離的酶活性不高，熱穩(wěn)定性差等因素，使微生物幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用及市場(chǎng)開(kāi)發(fā)受到嚴(yán)重限制。堅(jiān)信隨著熱穩(wěn)定微生物幾丁質(zhì)酶分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及其基因水平調(diào)控機(jī)理研究的深入，微生物幾丁質(zhì)酶將實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的大規(guī)模生產(chǎn)，其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒈贿M(jìn)一步擴(kuò)寬，市場(chǎng)發(fā)展前景也將越來(lái)越廣闊。

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Research progressand application statusof microbial chitinase

GONG Fuming1,HECaimei2,TANGXiaoyan1,LIU Chenjian3*
(1.DepartmentofClinicalMedicine,Dehong VocationalCollege,Mangshi678400,China; 2.College ofChem istry and Bioengineering，Hezhou University,Hezhou 542899,China; 3.Faculty ofLife Science and Technology,Kunm ing University ofScience and Technology,Kunm ing 650500,China)

Chitinase isa kind of glucoside hydrolasewhich can catalyze chitin hydrolysis to N-acetylglucosamine oligomersormonomers,and w idely found inmicrobe(fungi,bacteria,actinomycetesand viruses),animalsand plants.Because of its special physiological function,chitinase isw idely used in biological control,medicalapplication,wastemanagement,environmentalprotection and other field.The source and classification,fermentation conditions,enzymology propertiesand applicationsofmicrobial chitinasewere summarized,in order to provide theoreticalguidance for further developmentand application of chitinase.

chitin;m icrobial chitinases;fermentation conditions;enzymatic property;application

Q939.99

0254-5071（2017）08-0020-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.005

2017-04-13

云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2017ZZX109）

龔福明（1982-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c食品安全。

*通訊作者：柳陳堅(jiān)（1968-），教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物、食品營(yíng)養(yǎng)與安全。