姚方杰，孫文娟，魯麗鑫，王 鵬，陸 甲，張友民**

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌新種質(zhì)資源創(chuàng)制國(guó)際聯(lián)合研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所，吉林 公主嶺 136105）

毛木耳（Auricularia cornea Ehrenb.），是擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 蘑菇綱 （Agaricomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳屬（Auricularia） 的一種膠質(zhì)真菌[1]。毛木耳在我國(guó)17個(gè)省市（直轄市、自治區(qū)）均有栽培，其口感脆滑，素有“樹上海蜇皮”之美稱，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富，保健功能強(qiáng)大的天然食（藥） 用菌[2-3]。

根據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)毛木耳總產(chǎn)量約為168.64萬(wàn)噸，為我國(guó)第六大食用菌[4]。毛木耳生產(chǎn)周期較短，生物學(xué)效率高，栽培技術(shù)簡(jiǎn)單且生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益高，因此已經(jīng)成為很多貧困地區(qū)脫貧致富的首要選擇項(xiàng)目之一[5]。伴隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐步的加大，市場(chǎng)上出現(xiàn)隨便引種、品種退化、產(chǎn)量降低等諸多問題[6]，同時(shí)市場(chǎng)呈現(xiàn)多元化，消費(fèi)者對(duì)于毛木耳的需求逐年增加，對(duì)毛木耳的口感、色澤、品質(zhì)等要求趨于多樣。目前市場(chǎng)上毛木耳優(yōu)良品種匱乏，極大地阻礙了毛木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此加強(qiáng)優(yōu)良品種選育是毛木耳產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要內(nèi)容[4]。為此開展毛木耳顏色與商品性狀的遺傳研究和優(yōu)良雜交品種選育，為進(jìn)一步的遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)，為生產(chǎn)提供優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 親本菌株

親本一為栽培毛木耳菌株ZP，淺褐色，耳片大，扁圓形；親本二為野生毛木耳菌株YZ，白褐色，耳片小，近圓形。菌種均保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院。對(duì)照品種（CK） 為海南省當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N，與栽培菌株ZP相比，子實(shí)體較小，顏色較深。

1.2 雜交菌株制備

2個(gè)親本菌株的成熟耳片制備孢子印→單孢分離→單核菌株→單單雜交→雜交菌株，具體方法參照參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.1 孢子的收集與分離

選擇毛木耳成熟的耳片，用75%的酒精擦拭子實(shí)體表面，再用無(wú)菌水沖凈，后用無(wú)菌濾紙吸取多余水分，將其腹面朝下置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，12 h后培養(yǎng)皿底部可見1層白色的孢子印，取出子實(shí)體，封口培養(yǎng)皿待用[8]。

在超凈工作臺(tái)中，加入無(wú)菌水200 μL至收集到的含有孢子印的培養(yǎng)皿中，制成孢子懸濁液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水稀釋至濃度為100個(gè)/mL，用移液槍吸取200 μL的孢子懸濁液至平板培養(yǎng)基并用無(wú)菌的涂布器涂抹均勻，封口后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察孢子的萌發(fā)情況，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)星芒狀小菌落時(shí)，及時(shí)分離小菌落并挑取轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，進(jìn)行編號(hào)命名后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 單核菌絲的鑒定

分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的KOH溶液和1%剛果紅溶液，并各加入1滴在載玻片上，挑取培養(yǎng)后的單菌落置于溶液中并蓋上蓋玻片。將制好的玻片置于光學(xué)顯微鏡（物鏡40倍，目鏡10倍）中觀察菌絲有無(wú)鎖狀聯(lián)合，無(wú)鎖狀聯(lián)合的菌株為單核菌株[8]。

1.2.3 雜交組合的制備

分別將兩親本菌株的單核菌絲接入到同一平板培養(yǎng)基中，菌塊相距約1 cm，25℃進(jìn)行培養(yǎng)。待2個(gè)菌株的菌絲充分接觸后，挑取中間部位至斜面培養(yǎng)基中，并編號(hào)命名，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 雜交菌株的鑒定

雙核菌株的鑒定參考1.2.2，從有鎖狀聯(lián)合的菌株中選擇菌株ZP的1個(gè)單核菌株與菌株YS的3個(gè)單核菌株分別雜交，菌株ZP的3個(gè)單核菌株與菌株YS的1個(gè)單核菌株分別雜交，共形成5個(gè)雜交菌株（ZP-1×YS-1，ZP-1×YS-8，ZP-1×YS-17，ZP-2×YS-17，ZP-6×YS-17）。將雜交菌株與兩親本接入到同一平板培養(yǎng)基中，兩兩菌塊相距約2 cm，呈品字排列，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察雜交菌株與親本是有無(wú)明顯的拮抗線，淘汰與親本沒有拮抗線的菌株。再將雜交菌株之間對(duì)峙培養(yǎng)，觀察雜交菌株之間有無(wú)明顯的拮抗線，若無(wú)拮抗線，將其中生長(zhǎng)勢(shì)較弱的菌株淘汰[9]。

1.3 商品性狀遺傳分析

從雜交菌株中選出5個(gè)雜交菌株（ZP的1個(gè)單核菌株與菌株YS的3個(gè)單核菌株分別雜交，菌株ZP的3個(gè)單核菌株與菌株YS的1個(gè)單核菌株分別雜交），將其與兩親本同時(shí)開展進(jìn)行出耳試驗(yàn)，調(diào)查商品性狀（顏色、耳片形狀、大?。?，用于遺傳分析。

1.4 生產(chǎn)試驗(yàn)

將5個(gè)雜交菌株和對(duì)照品種同時(shí)在海南進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)，常規(guī)管理。培養(yǎng)料配方為菌草15.0%、木屑 62.0%、麥麩 20.0%、石灰 1.5%、石膏 1.5%，含水量58%～60%。調(diào)查生育期、產(chǎn)量具體方法按參照參考文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交組合的制備與真實(shí)性鑒定

將收集的親本菌株ZP和親本菌株YS的孢子印分離并培養(yǎng)，菌株經(jīng)過(guò)鏡檢獲得單核菌株。選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的單核菌株進(jìn)行單單雜交，共制備了100個(gè)雜交子。通過(guò)鏡檢確定這些雜交組合均具有鎖狀聯(lián)合，為真實(shí)雜交菌株。5個(gè)雜交菌株與兩親本進(jìn)行兩兩拮抗試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 雜交菌株的拮抗反應(yīng)Tab.1 The antagonistic reaction among Auricularia cornea hybrids

從表1可以看出，雜交菌株與親本之間均產(chǎn)生拮抗，各雜交菌株之間均產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象，說(shuō)明雜交菌株與兩親本以及雜交群體之間均為生理特性不同菌株。

表2 雜交菌株與親本的商品性狀Tab.2 Commercial character of Auricularia cornea hybrids

2.2 商品性狀遺傳

雜交菌株與親本的商品性狀統(tǒng)計(jì)見表2。

如表2所示，親本菌株ZP的1個(gè)單核菌株與另一親本菌株YS的不同單核菌株進(jìn)行雜交，親本菌株ZP的3個(gè)單核菌株與另一親本菌株YS的1個(gè)單核菌株進(jìn)行雜交，雜交菌株商品性狀差異明顯。兩親本雜交出來(lái)的F1菌株顏色均比親本顏色深，表現(xiàn)為超親遺傳，其中菌株ZY1、ZY3、ZY4為深褐色，菌株ZY2、ZY5為褐色。耳片厚度表現(xiàn)為超親遺傳，由大到小依次為ZY5>ZY4>CK>ZY1>ZY2>ZY3=ZP>YS。耳片長(zhǎng)寬比更小，呈扁寬圓形，雜交菌株的耳片長(zhǎng)度除ZY1菌株在兩親本之間，其他菌株均小于兩親本，長(zhǎng)度由大到小依次為ZP>ZY1>YS>ZY3>ZY2>ZY5>CK>ZY4，雜交菌株的耳片寬度均在親本之間，未出現(xiàn)超親現(xiàn)象。寬度由大到小依次為ZP>ZY1>ZY5>ZY3>CK>ZY2>ZY4>YS。

2.3 海南省生產(chǎn)試驗(yàn)

在海南省開展雜交菌株的生產(chǎn)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見圖1。

生產(chǎn)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜交菌株與對(duì)照品種在生育期方面相似，而產(chǎn)量和泡發(fā)度方面相差較大，如圖1所示，5個(gè)雜交菌株均適宜在海南省栽培，產(chǎn)量均超過(guò)對(duì)照品種，其中菌株ZP的1個(gè)單核菌株與菌株YS的3個(gè)單核菌株的雜交子ZY3、ZY1、ZY2分別比對(duì)照增產(chǎn)92.75%、75.36%、28.98%，說(shuō)明菌株YS的3個(gè)單核菌株的產(chǎn)量特性方面YS-17>YS-1>YS-2；親本菌株ZP的3個(gè)單核菌株與另一親本菌株YS的一個(gè)單核菌株（YS-17） 的雜交子 ZY5、ZY3、ZY4，分別比對(duì)照增產(chǎn) 113.04%、92.75%、62.22%，說(shuō)明菌株ZP的3個(gè)單核菌株的產(chǎn)量特性方面ZP-6>ZP-1>ZP-2，所以單核菌株YS-17與菌株ZP-6雜交而成的菌株ZY5的產(chǎn)量最高，高于對(duì)照品種113.04%。雜交菌株泡發(fā)度方面除了菌株ZY4小于對(duì)照，其余菌株均高于對(duì)照，其中ZY3>ZY1>ZY2，即在泡發(fā)度特性方面單核菌株YS-17>YS-1>YS-2；而由同一單核菌株YS-17與其他單核菌株雜交的菌株在泡發(fā)度方面ZY3>ZY5>ZY4，即菌株ZP的單核菌株在泡發(fā)度特性方面ZP-1>ZP-6>ZP-2，所以泡發(fā)度方面最高的是單核菌株YS-17與單核菌株ZP-1雜交而成的菌株ZP3，比對(duì)照品種高29.47%。

3 討論

本試驗(yàn)中，顏色較淺的2個(gè)親本菌株能雜交出深色品種，再次說(shuō)明無(wú)論顏色多么淺，都屬于有色類型，這與本團(tuán)隊(duì)關(guān)于毛木耳顏色遺傳的報(bào)道結(jié)果相似[11]。

本研究的生產(chǎn)試驗(yàn)地點(diǎn)為海南省，在選擇對(duì)照品種時(shí)，選擇的為當(dāng)?shù)氐闹髟云贩N而不是雜交菌株的親本是因?yàn)檫@樣能夠更好的體現(xiàn)雜交菌株在海南省的實(shí)際生產(chǎn)情況。當(dāng)?shù)厥秤镁a(chǎn)業(yè)起步晚、規(guī)模較小，很多品種也是由外地引入[12]。試驗(yàn)獲得的雜交菌株比海南當(dāng)?shù)仄贩N增產(chǎn)效果明顯，可能是這些雜交品種確實(shí)優(yōu)良，也可能因?yàn)楫?dāng)?shù)匾氲拿径贩N尚不適應(yīng)在海南栽培造成的。

雜交育種通常選擇兩親本各10個(gè)單核菌株進(jìn)行兩兩配對(duì)雜交[8]，這樣選擇的單核菌株較少且雜交配對(duì)組合較多，不能全面的選擇最優(yōu)的單核菌株。本試驗(yàn)在進(jìn)行雜交時(shí)選擇A菌株的1個(gè)單核菌株與B菌株的多個(gè)單核菌株分別雜交，篩選出B菌株的最優(yōu)單核菌株，同時(shí)選擇A菌株的多個(gè)單核菌株與B菌株的一個(gè)單核菌株分別雜交，篩選出A菌株的最優(yōu)單核菌株，然后用A菌株的最優(yōu)單核菌株與B菌株的最優(yōu)單核菌絲進(jìn)行雜交得到最優(yōu)的雜交菌株[13]。該方法可以最大可能的篩選出優(yōu)良組合，同時(shí)節(jié)省了雜交的時(shí)間，為食用菌雜交技術(shù)提供一個(gè)優(yōu)質(zhì)的方法。

耳片顏色、形狀和大小是毛木耳重要的商品性狀[14]，本文研究結(jié)果為毛木耳雜交育種提供了參考。同時(shí)，今后還要增加菌株數(shù)量，調(diào)查更多指標(biāo)，進(jìn)一步完善雜交菌株顏色遺傳規(guī)律的探究。