黃金鳳，李 波，白 瑩，馮禮燊，李文笙，孫彩云

（中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室/廣東省水生經(jīng)濟動物良種繁育重點實驗室/廣東省重要經(jīng)濟魚類健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

【研究意義】幾丁質是由β-1,4 糖苷鍵連接N-乙酰氨基葡萄糖的一種線性多糖，是自然界中唯一存在的陽離子型可食用纖維。幾丁質貯量十分豐富，僅海洋生物每年所合成的幾丁質已超過10 億t，是自然界中貯量僅次于纖維素的第二大天然多糖［1］。幾丁質多存在于真菌細胞壁、昆蟲消化道和多數(shù)節(jié)肢動物的外骨骼中，因此研究關于降解幾丁質的酶具有重要意義。幾丁質酶（EC 3.2.1.14）是一種糖苷水解酶，催化N-乙酰氨基葡萄糖從幾丁質上脫去，從而降解幾丁質。幾丁質酶根據(jù)其催化結構域的氨基酸序列相似性主要分為糖基水解酶（GH）家族18、19、23 和48，該酶在自然界分布廣泛，在細菌到高等植物和動物等生物體中均有分布，植物的幾丁質酶屬于GH19，魚類的幾丁質酶均為GH18，GH23 和GH48 分別在細菌和真菌中分布［2-4］。幾丁質酶具有多種生理作用，如促進甲殼類和昆蟲類蛻皮，降解魚類胃腸道里的蝦蟹殼幫助消化，在植物里則參與抵抗含有幾丁質的致病菌［4］，在魚皮膚粘液中抵抗寄生蟲等［5］。

【前人研究進展】魚類中的幾丁質酶最早在海鯛的胃腸道中被發(fā)現(xiàn)［6］。隨著基因組測序的快速發(fā)展，已研究獲得斑馬魚、日本比目魚等多種魚類的幾丁質酶序列［7］。肉食性海水魚類的天然食譜中含有豐富的幾丁質，如含有高結晶度α-幾丁質的蝦蟹和浮游動物，含有低結晶度β-幾丁質的烏賊等［4,8］。研究表明，魚類消化道組織具有幾丁質降解活性，其中胃中的幾丁質酶活性最高，降解幾丁質寡糖的活性比其他組織高，如白姑魚、日本鯖、斑鱾、琉球棘角魚和梭魚等。而降解單糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖酶的活性在各組織中廣泛分布，而非局限于消化道。不同的幾丁質降解酶的分布很可能取決于該魚類品種的飲食習慣和棲息地位置［4,9］。已有研究表明，從魚胃分離獲得的幾丁質酶約38～62 ku，與植物幾丁質酶大?。?4.5～29 ku）有明顯差異。在實驗室條件下，魚胃的丁質酶降解幾丁質低聚糖的最適pH 值為2.0～5.0，降解幾丁質多聚糖的最適pH 值為1.5～5.5。這表明魚類胃中的幾丁質酶適應胃組織的酸性環(huán)境來降解幾丁質底物［4］。

【本研究切入點】迄今為止，有關羅非魚幾丁質酶的研究報道僅有1 篇，它揭示了羅非魚血清、胃和腸中存在幾丁質酶降解活性，能夠降解4-甲基傘形酮-β-D-N,N-二乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）2〕或4-甲基傘形酮-β-D-N,N,N-三乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）3〕，其中血清中的幾丁質酶具有最高的比活性［10］。但目前仍未見關于羅非魚幾丁質酶序列及其功能的報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究克隆了吉富羅非魚3 種預測的酸性幾丁質酶，并對克隆結果進行了進化樹分析，同時檢測幾丁質酶在羅非魚中的組織分布，以期獲得相關功能信息。提取羅非魚胃組織蛋白并純化其中的幾丁質酶，測定酶活，比較羅非魚和其他魚類幾丁質酶的活性，為羅非魚幾丁質酶的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的吉富羅非魚（70～100 g）約為30 尾，均為雄性，購自廣東省國家羅非魚良種場。試驗前，供試羅非魚在12 h ∶12 h 黑暗光照循環(huán)條件下，室溫循環(huán)淡水中馴化1 周，每天9:30 和16:30進行飽食投喂。采樣前24 h內對羅非魚停食，在第2 天早上進行取樣。

主要試劑：總RNA 提取試劑Trizol Reagent、反轉錄試劑盒M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit 購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；聚合酶Blend taq plus 和連接試劑Ligation High，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；DNase Ⅰ 購自美國紐英倫生物技術公司；E.Z.N.A? Gel Extraction Kit、E.Z.N.A? Plasmid Extraction Kit，購自Omega Bio-Tek 公司；SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒、100 bp DNA Ladder，購自廣州東盛生物科技有限公司；DEPC、X-gal 和IPTG 購自生工生物工程（上海）公司。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。所用大腸桿菌DH5α 和pUCM-T載體購自英濰捷基（上海）貿易有限公司，感受態(tài)細菌則由本實驗室制備。其他試劑均為國產分析純。

主要儀器：凝膠成像分析系統(tǒng)和CFX Connect熒光定量PCR 儀購于伯樂生命醫(yī)學產品有限公司，VeritiTM PCR 儀、高速冷凍離心機5810R 和移液槍購于德國艾本德股份有限公司，核酸蛋白測定儀NanoDrop2000 購于美國應用生物系統(tǒng)公司，三洋制冰機購于日本SANYO 公司，微波爐購于廣東美的集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因cDNA 的克隆 根據(jù)NCBI 的尼羅羅非魚基因組中3 種預測的酸性幾丁質酶序列tChit1a（XM_039611991.1）、tChi3（XM_005464320.4）和tChit（XM_003459030.3），采用Primer 5 軟件設計特異性引物（表1）。

用丁香酚將羅非魚麻醉，斷頭處死，取出胃、腸用DEPC 水清洗，按照說明書用Trizol Reagent 進行總RNA 提取，用DNase Ⅰ去除基因組DNA，用反轉錄試劑盒反轉錄合成第一鏈cDNA，并以此為模板按照聚合酶Blend tap plus所要求的反應條件進行PCR 擴增，所用引物分別 為tChi1a-ORF-F/R、tChi3-ORF-F/R 和tChit-ORF-F/R（表1）。PCR 反應程序均為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃ 保存。對PCR 產物進行膠回收，加入pUCM-T 載體和Ligation High 室溫孵育連接，然后通過熱激法轉化至大腸桿菌DH5α 中，陽性克隆經(jīng)菌落PCR 鑒定后，送至生工生物工程（上海）公司進行測序。

表 1 羅非魚3 種幾丁質酶tChit1a、tChi3 和tChit 的ORFs 克隆引物及組織分布研究引物Table 1 Primers used in cloning of ORFs and tissue distribution study of three chitinases tChit1a,tChi3 and tChit in tilapia

1.2.2 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因序列的生物信息學分析 利用SignalP 5.0 尋找?guī)锥≠|酶tChit1a、tChi3和tChit基因的信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）［11］；利用ClustalW2軟件進行氨基酸序列同源性分析（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）［12］。通過NCBI 在線網(wǎng)站進行氨基酸序列相似度分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）［13］；采 用MEGA6.0 軟 件Neighbor-Joining 法進行進化樹分析［14］。

1.2.3 羅非魚tChit1a、tChi3和tChit基因的mRNA 組織分布 用丁香酚麻醉羅非魚，斷頭處死，迅速取出端腦、中腦、小腦、延髓、脊髓、下丘、垂體、鰓、心臟、腎、脾、脂肪、肝、胃、前腸、中腸、后腸、白肌、紅肌和性腺等組織，放入RNase-free 的1.5 mL 離心管中，立即放入液氮，之后置于-80 ℃冰箱中貯藏。按照1.2.1 克隆步驟進行總RNA 提取和反轉錄，以獲得的第一鏈cDNA 為模板，按照SYBR? Green 說明書進行實時定量PCR，所用引物為tChit1a-qt-F/R、tChi3-qt-F/R 和tChit-qt-F/R（表1）。PCR 反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；每個循環(huán)結束后在82 ℃收集熒光15 s；95 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃/2 s 的遞增速度，65～95 ℃下進行溫度梯度退火及收集熒光值。所測的值以18S rRNA 為內參進行標準化，2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 羅非魚胃幾丁質酶的純化 用丁香酚麻醉羅非魚，斷頭處死，取出其胃組織進行清洗，剪下內壁粘膜層置于PBS 緩沖液中破碎（70 Hz/ 120 s），隨后12 000 g 離心20 min 后收集上清用于純化。用幾丁質樹脂制備重力柱，根據(jù)說明書清洗柱子，隨后將樣品過幾丁質柱2 次，緩沖液清洗雜蛋白，然后加入洗脫液，關閉出樣口，4 ℃過夜。第2 天依次收集濾液，并進行蛋白濃度測定和Western blot 檢測。

1.2.5 SDS-PAGE及Western blot驗證 制備12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠，上樣后80 V 電泳30 min，120 V 電泳60 min。電泳結束，其中一塊PAGE膠用于G250 染色，另一塊PAGE 膠則按照正極-海綿-濾紙-NC 膜-PAGE 膠-濾紙-海綿-負極的順序夾緊，放在電泳槽中，裝置在冰浴中恒流200 mA 電泳60 min；電轉完的NC 膜用TBST緩沖液漂洗后浸入5%脫脂奶粉中封閉30 min；用1 ∶4 000 的斜帶石斑魚1 型幾丁質酶抗體稀釋液孵育過夜，最后放入Goat anti-rabbit IgG按1∶5 000 稀釋液中孵育1 h，最后滴加ECL 熒光混合液到膜上，在化學發(fā)光儀中顯色并拍照記錄。

1.2.6 酶活測定 采用4-甲基傘形酮（4-MU）熒光底物測定酶活。酶活定義為：在37 ℃下，每分鐘釋放1 μmol 4-MU 所需要的酶量，用U 表示。比活力用每克蛋白所含的酶活力單位（U/mg）數(shù)表示。1 μg 待測樣品、不同pH 的PBS 緩沖液和底物0.5 mmol/L 的4-甲基傘形酮-β-D-N,N-二乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）2〕或4-甲基傘形酮-β-D-N,N,N-三乙酰殼三糖〔4MU-（GlcNAc）3〕，在37 ℃下孵育70 min，然后用 0.5 mol/L Na2CO3緩沖液終止反應。用pH 7.4 的PBS 緩沖液配制梯度濃度0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 nmol 的4-MU 標準樣品，而待測樣品是1 μg 純化產物與2.5 nmol 的4MU-（GlcNAc）2/3，標準樣品和待測樣品的反應終體積均為100 μL，均在37 ℃、500 r/min 反應70 min，最后在每孔加入 100 μL 的 0.5 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應，用酶標儀在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長448 nm 下的熒光強度測定。

2 結果與分析

2.1 羅非魚3 種幾丁質酶的cDNA 及其編碼的氨基酸序列

從吉富羅非魚胃中克隆得到tChit1a的ORF序列，全長1 362 bp，編碼453 個氨基酸（AA）；Expasy 在線軟件預測蛋白大小為50.03 ku，等電點為6.14；SignalP 在線軟件預測結果顯示，前19 AA 為信號肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后為43 AA 的連接區(qū)域，最后為48 AA 的幾丁質結合域（圖1）。

從吉富羅非魚前腸和中腸中克隆得到tChi3的ORF 序 列，全 長1 362 bp，編 碼453 AA；Expasy 在線軟件預測蛋白大小為50.03 ku，等電點為5.39；SignalP 在線軟件預測結果顯示，前19 AA 為信號肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后是43 AA 的連接區(qū)域，最后為48 AA 的幾丁質結合域（圖1）。

圖1 羅非魚3 種幾丁質酶氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of amino acid sequences of three chitinases of tilapia

從吉富羅非魚中腸中克隆得到tChit的ORF序列，大小為1 422 bp，編碼473AA；Expasy 在線軟件預測蛋白大小為52.44 ku，等電點為5.68；SignalP 在線軟件預測結果顯示，前20 AA 為信號肽，緊接著為糖苷酶18 家族催化域343 AA，然后為49 AA 的連接區(qū)域，最后為61 AA 的幾丁質結合域（圖1）。

比對吉富羅非魚3 種幾丁質酶序列，結果顯示tChit1a 與tChi3 的氨基酸序列相似度為83.66%，而tChit 與tChit1a、tChi3 的相似度則較低，分別為49.89%和50.11%。從結構（圖1）來看，3 種幾丁質酶結構相似，在序列N 端具有信號肽和第18 家族糖苷催化域，C 端具有幾丁質結合域，中間由連接域連接。其中，tChit1a 和tChi3 結構相似，幾丁質酶催化活性位點序列一致，而tChit的連接域長于tChit1a 和tChi3 的連接域，有較多連續(xù)的蘇氨酸（Thr），且在催化活性位點有2 個氨基酸不一樣。

2.2 羅非魚3 種幾丁質酶的進行樹分析

本研究供試羅非魚與其他物種的幾丁質酶進化樹分析結果（圖2）顯示，羅非魚3 種幾丁質酶既不屬于哺乳動物的酸性幾丁質酶和幾丁三糖苷酶，也不屬于魚類酸性幾丁質酶1 和2，可歸類為魚類三型幾丁質酶，即非酸性幾丁質酶。

圖2 羅非魚與其他物種的幾丁質酶進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of chitinases among tilapia and other species

2.3 3 種幾丁質酶在羅非魚不同組織中的表達

3 種幾丁質酶在羅非魚不同組織中的表達結果顯示，tChit1a 在中腸的表達量最高，其次是前腸（圖3A）；而tChi3 在前腸的表達量最高，其次是中腸（圖3B）；tChit 主要在中腸后部表達（圖3C）?？梢?，羅非魚3 種幾丁質酶均主要在腸道中表達，在其他組織中表達量非常低。

圖3 幾丁質酶tChit1a、tChi3 和tChit mRNA 在羅非魚不同組織中的分布Fig.3 Distribution of tChit1a,tChi3 and tChit in different tissues of tilapia

2.4 羅非魚胃幾丁質酶的純化和酶活測定

利用幾丁質樹脂純化羅非魚胃幾丁質酶，SDS-PAGE 膠在40 ku 附近有兩條明顯條帶，50 ku 附近沒有明顯條帶（圖4A）。本研究所克隆獲得的3 種幾丁質酶tChit1a、tChi3 和tChit 預測的成熟肽大小分別為48.01、48.11、50.425 ku，但Western blot 驗證未在預測大小附近發(fā)現(xiàn)明顯條帶（圖4B）。用實驗室前期制備的斜帶石斑魚1型幾丁質酶多克隆抗體檢測，同樣沒有檢測到同源性高的條帶。

圖4 羅非魚胃幾丁質酶的純化結果Fig.4 Purification of chitinases extracted from the stomach of tilapia

用4-MU法檢測純化產物的幾丁質酶活性，結果如圖5所示，純化產物的幾丁質降解酶活性為弱酸性，在pH 4～7之間活性較高，最適pH值為5.0。1 μg純化產物與2.5 nmol的4MU-（GlcNAc）2/3反應70 min，在最適pH值下，降解4MU-（GlcNAc）2的酶活為1.73 U/g，降解4MU-（GlcNAc）3的酶活為4.89 U/g。

3 討論

本研究從吉富羅非魚中克隆獲得3 種幾丁質 酶tChit1a、tChi3和tChit的ORF，這3 種 幾丁質酶主要分布于中腸和前腸。tChit1a、tChi3和tChit 結構相似，均屬于18 家族幾丁質酶，預測的成熟肽大小分別為48.01、48.11、50.425 ku。其中tChit1a 和tChi3 的全長氨基酸序列相似性較高，達83.66%，催化活性位點序列一致，而tChit 在該位點與它們則有兩個氨基酸差異，表明tChit1a 和tChi3 親緣關系更近。進化樹分析表明，3 種幾丁質酶不屬于魚類酸性幾丁質酶-1（AFCase-1）和魚類酸性幾丁質酶-2（AFCase-2），而與魚類幾丁質酶-3（FCase-3）親緣關系更近。其中tChit 與金槍魚幾丁質酶3、比目魚幾丁質酶3 和虹鱒幾丁質酶聚成一起，而tChit1a 和tChi3 則聚成另一分支，說明它們親緣關系較近。為更有效降解食物中的幾丁質，硬骨魚魚類胃中表達兩種不同的幾丁質酶，即AFCase-1 和AFCase-2，它們具有不同A：12% SDS-PAGE；B：Western blot，一抗：斜帶石斑魚1 型幾丁質酶多克隆抗體（1 ∶4 000）M：Marker；1：純化樣品；箭頭指示克隆獲得的幾丁質酶預測大小位置

A:12% SDS-PAGE;B:Western blot by using polyclonal anti-Chitinase 1 ofEpinephelus lanceolatus（1 ∶4 000）M:Marker;1:Purified product;Arrowhead showed the predicted protein of tChit1a,tChi3 and tChit的降解模式，AFCase-1 優(yōu)先水解GlcNAc 鏈的非還原端的第二糖苷鍵，而AFCase-2 優(yōu)先水解第三糖苷鍵［15］。但關于FCase-3 的研究較少。在褐菖鲉肝臟和腎臟表達的一種幾丁質酶屬于FCase-3［16］。有關FCase-3 的降解特性還沒有報道。此外，羅非魚3 種幾丁質酶的等電點均在5～6.5 間，略小于7.0，說明這3 種酶均偏中性，推測它們發(fā)揮催化作用的環(huán)境pH 也偏中性，具體功能需要進一步探索。此外，為繼續(xù)探索羅非魚酸性幾丁質酶，本研究分析了來源于NCBI 的尼羅羅非魚基因組注釋的另外12 種羅非魚幾丁質酶，包 括XM_003440467.5、XM_003459039.4、X M_0 1 3 2 6 6 3 5 4.2、X M_0 1 9 3 4 9 7 5 6.2、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 2.1、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 1.1、X M_0 2 5 9 0 1 8 9 0.1、X M_0 1 9 3 4 9 7 5 0.2、X M_0 1 9 3 4 9 7 4 9.2、X M_0 0 5 4 4 8 5 6 1.3、XM_019355318.2 和XM_003459030.3，進化分析結果顯示，它們不屬于AFCase-1 和AFCase-2，均歸類為FCase-3。

研究表明，tChit、tChit1a 和tChi3 主要在羅非魚前腸和中腸表達，在胃中的表達量相對較低。其他物種研究表明，大菱鲆的3 種幾丁質酶在腸道高表達，其次是腦、皮膚和脾臟［17］；而日本沙丁魚幾丁質酶的高表達組織是性腺［15］；褐菖鲉幾丁質酶主要在肝和腎臟中表達［16］。不同的幾丁質酶同工酶可能發(fā)揮不同的作用，包括免疫、消化和蛻皮等［4,18］。本研究中，tChit、tChit1a 和tChi3 幾丁質酶均在腸道高表達，因此，推測這3種幾丁質酶可能主要將上游進行了部分分解的幾丁質寡糖再進一步水解，從而幫助機體消化吸收幾丁質。

為了解羅非魚是否存在高活性的酸性幾丁質酶，本研究通過純化胃蛋白以期獲得酸性幾丁質酶。已有多種具有活性的幾丁質酶在魚類胃中分離出來，且有多種同工酶，例如，在白姑魚的胃組織中純化獲得兩種大小分別為42、56 ku 的幾丁質酶［19-20］；在褐菖鲉胃中發(fā)現(xiàn)3 種大小分別為46、52、56 ku 的幾丁質酶［21］；在日本沙丁魚胃中純化得到大小為45、56 ku 的幾丁質酶［15］。在六線魚胃組織中純化出47、51、62 ku 等3 種幾丁質酶［22］。這些純化獲得的幾丁質酶具有較高的酶活性，能夠降解pNP-（GlcNAc）n，推測幾丁質酶活性與這些魚類棲息地和食物來源有關，它們均以海洋富含幾丁質的貝類、甲殼類或浮游生物為食，胃組織中高活性的幾丁質酶有助于它們消化食物中的幾丁質。幾丁質酶存在于許多魚類的胃中，但并不局限于胃組織，在其他組織中同樣發(fā)現(xiàn)幾丁質酶的表達和酶活性，例如在褐菖鲉腎臟中發(fā)現(xiàn)幾丁質酶mRNA 的表達［16］，在白姑魚腎臟檢測到幾丁質酶活性［23］，在日本鯖魚幽門盲囊中檢測到幾丁質酶mRNA［23］。但還未有研究展示胃以外組織的純化幾丁質酶結果。

在前期研究中，我們成功純化獲得鞍帶石斑魚和赤點石斑魚胃組織中的幾丁質酶，并通過了斜帶石斑魚1 型幾丁質酶多克隆抗體的Western blot 驗證。本研究中，我們首先從吉富羅非魚的胃組織中提取總蛋白，通過幾丁質樹脂親和層析法分離純化幾丁質酶，SDS-PAGE 結果顯示，我們只獲得約40 ku 的兩條條帶，且未能用多克隆抗體檢測到這兩條條帶。我們使用了較DNS法［24］更為靈敏的4-MU 法分析純化產物酶活性，結果顯示，在最適pH 5 的條件下，純化產物降解4MU-（GlcNAc）2的酶活為1.73 U/g，降 解4MU-（GlcNAc）3的酶活為4.89 U/g。以4-硝基 苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖〔pNP-（GlcNAc）n〕為底物，從六線魚胃組織純化獲得3 種幾丁質酶的最佳酶活分別為3.04、1.25、2.37 U/mg［22］，從白姑魚胃中純化獲得的兩種幾丁質酶降解pNP-（GlcNAc）3分別為0.109、2.07 U/mg［15］。本研究的羅非魚純化產物明顯低于這兩種魚的胃幾丁質酶。而檢測真鯛、海鱸魚、六線魚、太平洋鱈魚和黃尾鰤等胃組織粗酶液的幾丁質酶活性在0.24～1.59 U/g 之間［9］，與本研究獲得的純化產物幾丁質酶活性接近。推測羅非魚胃中的幾丁質酶蛋白表達量較低，通過幾丁質樹脂親和層析法并不能很好地純化幾丁質酶，后續(xù)可能需要用多種純化方法相結合，如在現(xiàn)基礎上再結合陰/陽離子交換層析方法等，以進一步分離天然的幾丁質酶，探究它們對不同形式完整幾丁質底物的降解特性及反應機制。幾丁質在海洋貯藏量非常豐富［25］，其中包括大量蝦蟹殼。在處理蝦蟹殼廢料方面，除了魚類幾丁質酶潛在的降解蝦蟹殼幾丁質的作用外，細菌幾丁質降解酶也是重要的潛在候選者。對蝦醬中篩選分離出來的細菌進行全基因組測序，灰色鏈霉菌CS1801 包含103 個糖苷水解酶家族基因，體現(xiàn)了幾丁質的降解潛力［26］。在海鮮工業(yè)廢物（蝦殼傾倒區(qū)）分離出的地衣芽孢桿菌（SSCL-10）的最高比活度為3.4 U/mL。對菌株進行化學誘變并通過紫外線照射來篩選潛在的幾丁質分解菌群，誘變模型已成功使突變型產生的幾丁質酶產量提高了5～6 倍［27］。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同于以貝類、甲殼類或者浮游生物為食的魚類，羅非魚3 種幾丁質酶tChit1a、tChi3和tChit主要在前腸或中腸中高表達，而在胃中的表達量很低。推測主要原因為羅非魚是棲息在水體中下層的魚類，是以植物性餌料為主的雜食性魚類，其食物中的蝦蟹殼所占比例較小，這種食性影響到羅非魚幾丁質酶的表達。因此，這3 種在羅非魚腸道不同位置表達的幾丁質酶可能不同程度地參與羅非魚的消化吸收，但降解幾丁質可能不是其主要功能。