曾維軍，屈坤杰，萬 誠，李 鵬，席培宇，李蕾佳，王濟紅

（1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.上海市巖土地質研究院有限公司，上海 200072）

【研究意義】毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl.var.lanuginosa）是樟科木姜子屬植物朝鮮木姜子（L.coreana）的變種，零星分布于貴州、四川、重慶、安徽、廣東和云南等亞熱帶地區(qū)。嫩葉是西南地區(qū)傳統(tǒng)茶飲老鷹茶的主要原料，具有消暑解渴、消食祛脹、降血糖血脂等功效［1-2］。在實際應用中，作為老鷹茶原料的毛豹皮樟種植于坡地，洪澇較少，但地理、氣候等環(huán)境因素造成的干旱缺水情況較多，制約毛豹皮樟的生長發(fā)育，間接影響老鷹茶的品質，所以在干旱脅迫下對毛豹皮樟進行植物逆境生理研究尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】近5 年，關于毛豹皮樟的研究主要集中在形態(tài)特征及地理分布［3］、遺傳選育［4］、開發(fā)及利用［5］、化學成分及藥理作用、生理特征、分子生物學等方面。例如，唐茜等［6-7］研究表明，礦物質營養(yǎng)主要是鉀、鎂、磷、鈣、鈉、鐵和錳，均為人體必需營養(yǎng)，其中鉀參與人體蛋白質、氨基酸和碳水化合物的代謝，對心臟和心血管具有保護作用，能降低血壓［8］。范川等研究了毛豹皮樟苗木對低溫脅迫的生理響應，發(fā)現(xiàn)毛豹皮樟的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量在處理溫度及品種間具有顯著差異，均可作為毛豹皮樟抗寒性評價指標，同時還發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（SOD）與毛豹皮樟抗?jié)承杂袠O強的相關性［5］；經方差分析發(fā)現(xiàn)，毛豹皮樟的CAT、POD 活性及SS、MDA 含量在處理溫度及品種間都有顯著差異，均可作為毛豹皮樟抗寒性評價指標［9-10］。鞏艷紅等［11］采用改良SDS 法從毛豹皮樟的老、幼葉片中提取到高質量DNA，可以用于RAPD 分析，從4組隨機引物中篩選出16 個顯示毛豹皮樟遺傳差異的多態(tài)性引物，該方法適用于毛豹皮樟的種質資源鑒定分析。【本研究切入點】關于逆境生理下葉片光合能力及組織形態(tài)差異的相關研究少見報道，不能進一步闡明毛豹皮樟生理生態(tài)的相關規(guī)律?！緮M解決的關鍵問題】本研究以用于生產種植的毛豹皮樟扦插苗為研究對象，探究不同程度干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片組織結構及光合作用的影響，探究毛豹皮樟扦插苗逆境生理特性，為其高效栽培管理技術提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為毛豹皮樟3年生扦插苗，平均株高25（±2）cm、基徑粗3（±0.5）mm，由貴州省生物研究所培育。

1.2 試驗地點

試驗地點位于貴州省湄潭縣興隆鎮(zhèn)丁家溝村（107°48′E、27°67′N）。試驗場地為覆膜簡易大棚，用透光率50%的遮陽網做外遮陽，溫度為自然變溫，簡易塑料大棚上覆蓋透光率為50%的遮陽網。試驗地屬亞熱帶濕潤季風氣候，夏季溫暖濕潤，冬季干燥寒冷，年均氣溫14.9℃，最冷月（1 月）平均氣溫3.8℃，最熱月（7 月）平均氣溫25.1℃，無霜期平均284 d，年日照時數 1 163 d。試驗于2018 年6 月進行，該月平均氣溫25.6℃。

1.3 試驗方法

用口徑15 cm×高20 cm 塑料盆栽植，栽培基質為腐質土、蛭石（體積比1 ∶1）的混合基質；每盆裝入基質1.0 kg，定植1 株。確定混合基質田間最大持水量，設置4 種不同程度的干旱脅迫處理：CK（土壤體積持水量為39.6%）、輕度（土壤體積持水量為29.2%）、中度（土壤體積持水量為19.5%）、重度（土壤體積持水量為9.7%），采取稱重法定期補水。每個處理30 株苗，3 次重復。2018年1月2日定植，2月1日開始處理（定植30 d），5 月5 日后所有處理統(tǒng)一水管理（5 d 澆一次透水），6 月5～10 日開始取樣和測量相關指標。

1.4 測定方法

1.4.1 光合日變化測定 6 月5 日，晴天，8：00～ 18：00，每隔1 h 分別選定相同干旱處理下3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝的一片成熟葉，使用Li6400光合測定儀（LI-COR，美國）測量其凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr），同時記錄光合有效輻射（PAR）、空氣中CO2濃度（Ca）、空氣溫度（T）及相對濕度（RH）。

1.4.2 光合氣體交換參數測定 6 月10 日，晴天，9：30～11：30，使用帶紅藍光源的LI6400 光合測定儀（LI-COR，美國），以對照頂枝葉片光響應曲線光飽和點（1 192 μmol/m2·s）為參考，設定光強1 100 μmol/m2·s，選定相同干旱處理下3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝的一片成熟葉，測量其Pn、Gs、Ci、Tr。

1.4.3 葉片氣孔限制值水分利用效率、計算 氣孔限制值Ls=1-Ci/Ca。其中，Ca 為空氣中CO2濃度。水分利用效率WUE=Pn/Tr。

1.4.4 葉綠素總量測定 不同干旱脅迫程度下各選取3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝一片成熟葉，使用UV-1800SPC 雙光束紫外分光光度計（Macy，中國美析儀器有限公司），采用丙酮乙醇混合液法測定葉綠素總量（Tc）［12］。

1.4.5 葉片組織結構測量 不同干旱脅迫程度下各選取1 株毛豹皮樟扦插苗頂枝一片成熟葉進行制片，使用Primovert 顯微鏡（ZEISS，德國卡爾·蔡司股份公司）在每張切片上隨機挑選5 個200 倍視野進行觀察和拍照。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件以200 倍標尺為標準，選取10 處測量每張片子上表皮厚度、下表皮厚度，測量柵欄組織和海綿組織的厚度、密度（每個視野中柵欄組織和海綿組織的個數）。

1.5 數據處理

使用Graph Pad Prism9.0，對不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數、水分利用效率、氣孔限制值、葉綠素總量進行方差分析，采用S-N-K 法進行多重比較，實現(xiàn)數據實時可視化。使用SPSS24.0 軟件，采用皮爾遜相關性分析法對光合和環(huán)境日變化參數進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化的影響

由表1可知，輕度干旱脅迫下毛豹皮樟扦插苗葉片沒有明顯的光合午休現(xiàn)象，曲線呈單峰型，日均凈光合速率為3.53 μmol/m2·s，15：00 時凈光合速率達峰值6.22 μmol/m2·s；CK、中度、重度干旱脅迫的日均凈光合速率分別為3.69、3.33、1.97 μmol/m2·s，均存在明顯光合午休現(xiàn)象，其中CK曲線呈單峰型，光合午休時間最短、為1 h；中度、重度干旱脅迫的光合日變化為雙峰曲線；重度干旱下凈光合速率日變異系數最大、為68.23%，CK最小、為28.65%。

表1 不同干旱脅迫程度下豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化Table 1 Diurnal changes of net photosynthetic rate of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings under different drought stresses

2.2 不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數日變化相關性分析

如表2 所示，在毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數的16 組對應組合中，CK 有10 組對應組合顯著相關，輕度干旱脅迫有15 組，中度干旱脅迫15 組，重度干旱脅迫11 組；CK 的Ci 與RH 的正相關性最高、相關系數為0.689，Tr 與RH 的負相關性最高、相關系數為-0.593；輕度干旱脅迫下，Ci 與RH 的正相關性最高、相關系數為0.870，Pn 與Ca 的負相關性最高、相關系數為-0.920；中度干旱脅迫下，Gs 與RH 的正相關性最高、相關系數為0.749，Gs 與T 的負相關性最高、相關系數為-0.723；重度干旱脅迫下，Gs與RH 的正相關性最高、相關系數為0.913，Gs與T 的負相關性最高、相關系數為-0.869。

表2 不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數日變化相關性Table 2 Correlation of diurnal changes of leaf photosynthetic and environmental parameters of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings under different drought stresses

2.3 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數的影響

如圖1 所示，隨著干旱脅迫程度增加，毛豹皮樟扦插苗葉片Pn 均值顯著降低，數據離散程度增加，中度干旱脅迫的Pn 均為接近于0 的負值；CK 的Gs 顯著高于其他3 個干旱處理，中度、重度干旱脅迫下的Gs 差異不顯著；兩者Ci 均值較高，CK 的Ci 均值較低，CK、重度干旱脅迫的Ci值聚集程度較高；處理間Tr 相比較，CK 與輕度干旱脅迫差異不顯著，但顯著高于中度、重度干旱脅迫。

圖1 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數的影響Fig.1 Effects of drought stresses on gas exchange parameters of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

2.4 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片水分利用效率、氣孔限制值和葉綠素總量的影響

由圖2 所示，中度、重度干旱脅迫下毛豹皮樟扦插苗葉片的Ls、WUE 均為負值，其中重度干旱脅迫下的Ls 值最低，中度干旱脅迫下的WUE 值最低，輕度干旱脅迫下的Ls 顯著高于CK，CK 的WUE 顯著高于輕度干旱脅迫，是輕度干旱脅迫下的近兩倍。CK 的Tc 為1.61 mg/L，極顯著高于輕度、重度干旱脅迫，顯著高于中度干旱脅迫，其中輕度和重度干旱脅迫下的WUE 差異不顯著，但均顯著低于中度干旱脅迫。

圖2 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片水分利用效率、氣孔限制值和葉綠素總量的影響Fig.2 Effect of drought stresses on WUE,Ls and Tc of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

2.5 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結構的影響

由圖3、圖4 可知，3 個干旱處理的毛豹皮樟扦插苗葉片上表皮厚度均顯著小于CK；隨著干旱脅迫程度增加，葉片下表皮厚度先減后增；CK 的柵欄組織厚度最高、輕度最低；海綿組織厚度均值的變化隨干旱脅迫的加強而先增后減，重度干旱脅迫的海綿組織厚度均值最高、為0.097 mm；干旱處理下的葉片柵欄組織密度與CK 相比均不顯著；輕度干旱脅迫的葉片海綿組織密度為179 個，顯著高于CK。

圖3 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織顯微結構的影響Fig.3 Effects of drought stresses on the microstructure of leaf transverse tissue structures of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa

圖4 干旱脅迫對毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結構的影響Fig.4 Effect of drought stresses on leaf transverse tissue structure of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

3 討論

“光合午睡”過長不利于植物光合作用積累有機物。對照、中度、重度干旱脅迫下毛豹皮樟均有明顯“光合午睡”現(xiàn)象，中度時間最長，輕度干旱脅迫無此現(xiàn)象，說明輕度干旱脅迫能打破毛豹皮樟“光合午睡”，但繼續(xù)干旱脅迫會加重該現(xiàn)象，不利于光合作用。光合能力是植物進行新陳代謝的基礎，也是影響作物品質和產量的重要條件［13］。凈光合速率反映植物積累有機物快慢，是衡量光合能力的重要參數。凈光合速率日變化模式有雙峰型、單峰型、平坦型和不規(guī)則型等多種類型［14］，不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化類型主要是雙峰型和單峰型。重度干旱脅迫下的凈光合速率日變異系數最大，高于對照2 倍，同時均值和最大值也最低，說明自然環(huán)境中遇到嚴重干旱，毛豹皮樟利用光能合成有機物的水平較低且不穩(wěn)定。隨著干旱程度增加，光合參數與環(huán)境因子的相關性先增后降，且相關程度也在發(fā)生變化，其中關聯(lián)性較高的環(huán)境因子為空氣相對濕度和溫度。

干旱脅迫往往顯著降低植物的光合作用［15］，與本試驗中“毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率均值伴隨干旱脅迫程度增加而顯著降低”的結論相似。對照的氣孔導度高，胞間CO2濃度低，干旱脅迫下則相反，說明干旱脅迫顯著影響毛豹皮樟扦插苗葉片的氣孔開張程度，讓氣孔變小甚至關閉，導致胞間CO2濃度升高。中度和重度干旱下，氣孔限制值和水分利用效率呈負值，說明中度干旱開始毛豹皮樟扦插苗已經缺水、葉片氣孔不能正常工作，同時影響葉片葉綠素合成、葉綠素總量降低，但在中度干旱下，葉綠素總量有小幅增加，可能是毛豹皮樟響應干旱脅迫的應激反應。

在自然生長條件下，核酮糖-1,5-二磷酸梭化酶／加氧酶（Rubisco）的活化、核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）的再生是完整葉片以最佳狀態(tài)進行光合作用的兩個重要代謝步驟，主要發(fā)生在葉片的柵欄組織和海綿組織細胞內［16-17］。細胞內真正的CO2供應速率，則受葉片表皮部分氣孔保衛(wèi)細胞的控制［18-20］。3 個干旱處理的葉片上表皮厚度均顯著小于對照，說明干旱脅迫通過改變表皮氣孔保衛(wèi)細胞的狀態(tài)來影響CO2供應速率，從而影響毛豹皮樟扦插苗的光合速率；CK 葉片柵欄組織厚度最高，重度干旱脅迫最低，中度干旱脅迫的葉片海綿組織厚度均值最高，輕度干旱脅迫的葉片海綿組織密度最高與中度、重度干旱脅迫差異不顯著，說明毛豹皮樟扦插苗葉片在干旱脅迫下響應光合作用而特化出來的細胞減少、氣體交換增加，柵欄組織是豹皮樟扦插苗葉片傳遞環(huán)境改變信號的傳遞層，而海綿組織則是應對這種環(huán)境改變的反應層。

4 結論

干旱脅迫影響毛豹皮樟扦插苗葉片“光合午睡”時長、凈光合速率日變化及氣體交換參數與環(huán)境因子的相關性，重度干旱加重“光合午睡”，降低光合能力，維持葉片正常光合生理需增加空氣水分、降低溫度；干旱脅迫影響毛豹皮樟扦插苗葉片氣孔開張狀態(tài)和葉綠素總量，中度干旱下能增加葉片葉綠素總量來響應干旱脅迫，重度干旱嚴重影響其水分利用和氣體交換；毛豹皮樟扦插苗通過降低葉片上表皮厚度、增加柵欄組織厚度、降低海綿組織厚度來響應干旱脅迫。