多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成。多肽是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)片段，也是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的活性基團(tuán)，是人體進(jìn)行代謝、調(diào)控活動(dòng)的重要物質(zhì)。蛋白質(zhì)主要以多肽形式吸收，透過(guò)多肽既可深入研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)，又為改變和合成新的蛋白質(zhì)提供了基礎(chǔ)材料。研究多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效，以便應(yīng)用中設(shè)計(jì)盡可能短的多肽同時(shí)提高其生理活性，減少臨床的不良反應(yīng)。隨著美國(guó)FDA1999年開(kāi)始允許大豆蛋白制品標(biāo)注可以預(yù)防心血管疾病的功能和人們對(duì)多肽中各氨基酸系列的功效的不斷了解，作為藥物和營(yíng)養(yǎng)品的多肽產(chǎn)品不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)，多肽的研發(fā)已成為近年生命科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)[1～7]。

1 多肽的合成

1.1 多肽合成的分類

多肽的合成主要有兩條途徑：化學(xué)合成和生物合成。

化學(xué)合成主要通過(guò)氨基酸縮合反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。為得到具有特定順序的合成多肽，當(dāng)合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時(shí)，應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)，然后再進(jìn)行連接反應(yīng)，以保證合成的定向進(jìn)行。

多肽的化學(xué)合成有固相合成和液相合成之分，其主要的區(qū)別在于是否使用固相載體。多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略，逐步合成簡(jiǎn)潔迅速，被用于各種生物活性多肽片段的合成；片段組合法為合成含100個(gè)以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線，并已成功地合成了多種有生物活性的多肽，其最大的特點(diǎn)是易于純制。1963年，Merrifield創(chuàng)立了固相合成法，將氨基酸的C末端固定在不溶樹(shù)脂上，然后在此樹(shù)脂上依次縮合氨基酸、延長(zhǎng)肽鏈。固相合成法又可分為Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基) 法。在傳統(tǒng)液相和固相合成多肽方法的基礎(chǔ)上，人們又發(fā)展了氨基酸的羧內(nèi)酸酐(NCA)法、液相分段合成法、組合化學(xué)法等。

在生物合成多肽方面，除了常用的發(fā)酵法、酶解法外，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，DNA重組技術(shù)也被應(yīng)用于合成多肽。

1.2 氨基酸的羧內(nèi)酸酐法[8，9]

氨基酸的羧內(nèi)酸酐是氨基酸的一種衍生物，它的氨基保護(hù)基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開(kāi)環(huán)聚合機(jī)理，其引發(fā)劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應(yīng)包括：在堿性條件下，氨基酸陰離子進(jìn)攻NCA形成較為穩(wěn)定的氨基甲酸根離子，在酸化時(shí)該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進(jìn)攻其它的NCA,如此反復(fù)進(jìn)行下去(圖1)。

圖1 NCA法合成多肽路線

NCA法具有合成周期短、操作簡(jiǎn)單、成本較低、產(chǎn)物分子量高等優(yōu)點(diǎn)，在目前多肽合成中所占比例較大，技術(shù)也較為通用。但是，采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段[9]。

1.3 液相分段合成法[10～19]

液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性，自發(fā)連接成長(zhǎng)肽的合成方法,其優(yōu)點(diǎn)是能得到長(zhǎng)肽，但技術(shù)還不完善。常用的連接技術(shù)主要有：天然化學(xué)連接[11]、化學(xué)區(qū)域選擇連接[12，13]、可去除輔助基連接[14]、光敏感輔助基連接[15]、施陶丁格連接[16，17]和正交化學(xué)連接[18，19]。

天然化學(xué)連接方法(圖2)是以C端為硫酯的多肽與N端為半胱氨酸(Cys)殘基的多肽反應(yīng)得到以Cys為連接位點(diǎn)的多肽。由于連接所合成的多肽必須含Cys殘基，限制了該方法的應(yīng)用。

非線性多智能體系統(tǒng)的分布式編隊(duì)控 制 ……………………………… 連文瑜，劉 佳，張運(yùn)喜，李偉勛（44）

圖2 天然化學(xué)連接反應(yīng)

化學(xué)區(qū)域選擇連接方法(圖3)是以2-巰芐基作為輔助基與硫酯反應(yīng)。加快了縮合速度，輔助基易脫除，且去除輔助基連接是以苯胺的衍生物Nα-(1-苯基-2-巰乙基)為輔助基團(tuán)，對(duì)強(qiáng)酸保持穩(wěn)定，使得N端多肽片段較易合成。

圖3 化學(xué)區(qū)域選擇連接反應(yīng)

光敏感輔助基連接方法(圖4)是以Nα-2-巰基-1-(2-硝基苯)乙基為輔助基(見(jiàn)光分解易脫除)合成多肽的。

圖4 光敏感輔助基連接反應(yīng)

施陶丁格連接方法(圖5)是以疊氮反應(yīng)為基礎(chǔ)，以C端的膦硫酯和N端的疊氮化合物反應(yīng)生成酰胺膦鹽，酰胺膦鹽水解得到多肽和膦氧化物。

圖5 施陶丁格連接反應(yīng)

正交化學(xué)連接方法是改進(jìn)的施陶丁格連接方法，通過(guò)簡(jiǎn)化膦硫酯輔助基來(lái)提高片段間的縮合率。

1.4 組合化學(xué)法[20～25]

組合化學(xué)法是20世紀(jì)80年代在固相多肽合成的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它將氨基酸的構(gòu)建單元按某種組合方式連接起來(lái)，合成出包含大量化合物的化學(xué)庫(kù)，并從中篩選出具有某種物理、化學(xué)或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。與傳統(tǒng)合成方法不同的是，傳統(tǒng)合成方法一次只合成一種化合物，而組合化學(xué)法可同時(shí)合成多種化合物。常用的合成策略方法主要有：混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫(kù)法、茶葉袋法[21]等。Dubs等[25]利用化學(xué)選擇平行方法，得到了含有102種兩親性黑色素細(xì)胞刺激素(R-MSH)的類似物的肽庫(kù)。經(jīng)藥理測(cè)試發(fā)現(xiàn)，其中84種化合物的AMPs的誘導(dǎo)性高于已應(yīng)用的R-MSH促效劑Melitane。

組合化學(xué)法能最大限度地篩選各種新化合物及其異構(gòu)體，從而首先找到具有藥效作用的先導(dǎo)物，是世界各大醫(yī)藥公司普遍采用的方法。目前面臨的問(wèn)題是：如何提高合成化合物組合庫(kù)的分子多樣性和開(kāi)發(fā)與之配套的敏感有效的快速分析和鑒定手段。

1.5 酶解法[26，27]

用酶解法合成多肽，又稱酶法多肽，就是用生物酶降解蛋白質(zhì)，將動(dòng)植物大分子蛋白質(zhì)降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質(zhì)所用的酶，大多數(shù)是肽酶類。近年來(lái)，人們運(yùn)用酸、堿降解蛋白質(zhì)獲得多肽收獲甚微，固定投資大，周期長(zhǎng)，污染嚴(yán)重，風(fēng)險(xiǎn)大，未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。武漢九生堂的鄒遠(yuǎn)東教授利用酶解法開(kāi)發(fā)出大豆多肽、大豆寡肽、鮑魚(yú)肽[26]、海參肽、苦瓜肽[27]、魚(yú)翅肽、燕窩肽等一系列多肽產(chǎn)品，在酶法多肽方面做出了杰出貢獻(xiàn)。

酶法多肽具有以下優(yōu)點(diǎn)：酶解不降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可獲得比原食品蛋白質(zhì)更多的功能；可保持多肽營(yíng)養(yǎng)純天然綠色屬性，不含任何化學(xué)物質(zhì)等。但酶解得到的是一系列多肽，分離純化難度較大，因此不適于合成單一的多肽。另外，肽酶的催化具有專一性，因此，尋找合適的肽酶也是該方法的一個(gè)難點(diǎn)。

1.6 基因工程法[28]

DNA 重組技術(shù)的誕生為合成序列確定的多肽奠定了基礎(chǔ)，即可通過(guò)設(shè)計(jì)合適的DNA模板來(lái)控制多肽的序列。利用DNA重組技術(shù)，可以通過(guò)重組DNA產(chǎn)生的工程菌來(lái)大量高效地合成多種生物活性多肽。

Urry等在大腸桿菌中表達(dá)了似彈性蛋白——聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)，是基因工程技術(shù)應(yīng)用于多肽合成的范例。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的活性多肽還有肽類抗生素[28]、干擾素類、白介素類、生長(zhǎng)因子類、腫瘤壞死因子、人生長(zhǎng)激素、凝血因子、促紅細(xì)胞生成素、組織非蛋白纖溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表達(dá)定向性強(qiáng)、產(chǎn)品安全衛(wèi)生、原料來(lái)源廣泛和成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以得到質(zhì)量高、療效好且具有天然活性的多肽類藥物，但存在高效表達(dá)等技術(shù)難題，分離困難，產(chǎn)率低，成本昂貴，難以用于規(guī)模生產(chǎn)。

1.7 發(fā)酵法[29]

發(fā)酵法是從培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中提取多肽的方法。目前，微生物能夠獨(dú)立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(藍(lán)細(xì)菌肽)。發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)是工業(yè)化成本低，但是產(chǎn)物范圍窄，且產(chǎn)物提純復(fù)雜。

2 多肽的應(yīng)用

目前，多肽的應(yīng)用主要集中在多肽藥物、多肽藥物載體、組織工程材料和多肽營(yíng)養(yǎng)食品等方面。

2.1 多肽藥物[30～35]

除了傳統(tǒng)的多肽類激素外，對(duì)多肽類藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)發(fā)展到疾病防治的各個(gè)領(lǐng)域：多肽疫苗可用于SARS病毒[31]、肝炎、艾滋病等病毒性傳染病的預(yù)防；與腫瘤基因靶點(diǎn)特異結(jié)合的多肽可用于治療腫瘤[32～34]；從肽庫(kù)內(nèi)篩選細(xì)胞因子模擬肽；多個(gè)抗菌肽可殺死腫瘤細(xì)胞；天然植物中分離出的一些小肽可治療心血管疾病等。此外，在診斷試劑中多肽的用途主要是用作抗原檢測(cè)寄生蟲(chóng)的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲(chóng)蛋白抗原的特異性強(qiáng)，也易于制備，且易于臨床應(yīng)用。

2.2 多肽藥物載體[36，37]

多肽用作藥物載體，既可以用作藥物載體的修飾劑，也可以作為藥物載體的主要組成部分。Law等[36]設(shè)計(jì)了蛋白酶斷裂點(diǎn)連接的肽段在合適的溶劑中自組裝后將藥物包覆在微球內(nèi)，遇到靶向蛋白酶使得斷裂點(diǎn)斷開(kāi)，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向釋放，如圖6所示。

圖6 酶釋放載藥多肽基體的設(shè)計(jì)

彭師奇等將精氨酸-甘氨酸-天氨酸-絲氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser，RGDS)四肽修飾脂質(zhì)體用作藥物載體導(dǎo)向溶栓。運(yùn)用血小板的纖維蛋白原(FG)受體配基RGDS肽作為導(dǎo)向歸巢裝置, 偶聯(lián)于包裹尿激素UK的脂質(zhì)體。載體與藥物之間以酸敏感性共價(jià)鍵的形式連接,在自然界或人體內(nèi)能生物降解成內(nèi)源性物質(zhì)Glu,不易產(chǎn)生積蓄和毒副作用。

2.3 組織工程材料[38，39]

一些不具有生物活性的高分子多肽，如聚天冬氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸等，由于具有良好的生物相容性、可控生物降解速率、可修飾性、設(shè)計(jì)的可塑性、結(jié)構(gòu)的可控性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為組織工程中極具應(yīng)用前景的一類新型材料。Langer等制備了聚(乳酸-賴氨酸)，將RGD肽接枝到聚合物中賴氨酸的-NH2上，有效提高了聚合物表面的細(xì)胞粘附能力，克服了主鏈無(wú)活性基團(tuán)的不足，獲得的組織工程支架材料既便于細(xì)胞識(shí)別，又能支持細(xì)胞生長(zhǎng)[39]。

2.4 多肽營(yíng)養(yǎng)食品[40]

活性肽類食品作為一種新型保健食品,具有獨(dú)到的特性和功能,在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上也有著許多優(yōu)點(diǎn),在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)來(lái)源不同，活性肽營(yíng)養(yǎng)食品主要有以下幾類：乳蛋白肽類制品、植物肽類制品、膠原肽類制品、畜產(chǎn)類和水產(chǎn)類多肽制品等。

3 展望

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)多肽產(chǎn)業(yè)繼續(xù)保持著迅猛發(fā)展的態(tài)勢(shì)。多肽合成公司紛紛建立，合成和提取技術(shù)不斷改進(jìn)，越來(lái)越多的多肽產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。但是，作為新興產(chǎn)業(yè)，多肽的合成與應(yīng)用面臨著研發(fā)力量薄弱、仿制、低水平重復(fù)等問(wèn)題。因此，加大研發(fā)投入、科技創(chuàng)新、提高多肽穩(wěn)定性、降低成本、開(kāi)發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的多肽產(chǎn)品成為當(dāng)務(wù)之急。

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