腈水合酶是以硫原子和半胱氨酸——亞磺酸殘基為絕對中心的能催化腈類化合物轉化為相應的酰胺類化合物的同工酶[1,2]。不同菌株所產(chǎn)腈水合酶在結構和特性上存在較大差異。目前已知能產(chǎn)腈水合酶的微生物有紅球菌(Rhodococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、假諾卡氏菌(Pseudoncardia)、節(jié)桿菌(Arthobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)、諾卡氏菌(Nocardia)、叢毛單胞菌(Comamonas)、棒狀桿菌(Corynebaterium)及短桿菌(Brevibacterium)[3]。腈水合酶生產(chǎn)菌株最初主要是利用其產(chǎn)生的腈水解酶處理含腈污水，經(jīng)過誘變培養(yǎng)后，菌株以產(chǎn)腈水合酶為主，用來催化腈類物質與水發(fā)生加成反應生成酰胺類物質(如丙烯酰胺)。目前國內(nèi)利用生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的企業(yè)已超過10家，每年總產(chǎn)量超過20萬t,還有許多公司計劃擴建生產(chǎn)裝置[4～7]。

腈水合酶催化丙烯腈水合反應技術是生物法生產(chǎn)丙烯酰胺的核心技術。由于菌株在產(chǎn)腈水合酶的同時也產(chǎn)生一定的腈水解酶，其催化反應過程中，不僅催化丙烯腈與水反應生成丙烯酰胺，還催化丙烯酰胺與水發(fā)生水解反應生成丙烯酸。反應如下：

催化反應過程生成的反應液由于電導率高而難于精制，不僅耗水量大、廢水多、產(chǎn)率低，而且使離子樹脂精制塔再生頻繁，大大增加了生產(chǎn)成本、嚴重影響了產(chǎn)品質量。為此，作者對腈水合酶催化反應液電導率的控制進行了研究。

1 實驗

1.1 菌種

諾卡氏菌(Nocardia)。

1.2 氣相色譜分析條件

柱箱溫度190℃，運行時間6 min；進樣口模式為分流，分流比40∶1，加熱器溫度200℃，壓力110.5 kPa，載氣為氮氣，總流量77.7 mL·min-1，分流流量73.2 mL·min-1；色譜柱：毛細管柱，Agilent Q 10.0 m×320 μm×20.0 μm，最高柱溫270℃，模式為恒定壓力，壓力110.5 kPa，額定初始流量1.8 mL·min-1，平均速率59 cm·min-1，出口壓力為環(huán)境壓力；檢測器：氫火焰離子檢測器，溫度250℃，模式為恒定柱流加尾吹，氫氣流量30.0 mL·min-1，空氣流量300.0 mL·min-1，合并流量30.0 mL·min-1；進樣針：注射器尺寸5.0 μL，進樣體積1.0 μL。

1.3 分析方法

采用外標分析法(進樣量1.0 μL)檢測丙烯酸含量；采用EF30K型電導率儀(梅特勒公司)測定電導率。

2 結果與討論

2.1 影響腈水合酶催化丙烯腈反應液電導率的因素

研究發(fā)現(xiàn)，影響反應液電導率的因素主要有加入菌體帶入的無機鹽和菌體的代謝產(chǎn)物、催化反應過程中由于菌體死亡發(fā)生自溶產(chǎn)生的氨基酸等有機類物質、菌體細胞中含有的腈水解酶。

在工業(yè)生產(chǎn)過程中，當加入規(guī)定量的發(fā)酵液離心后的菌體后，測定游離細胞液的電導率為176 μS·cm-1，催化反應結束后測定反應液的電導率為1102 μS·cm-1，反應液中丙烯酸的含量為1429×10-6。為考察丙烯酸含量對反應液電導率的影響，用脫鹽水配制不同含量的丙烯酸溶液，并測定相應溶液的電導率，結果見表1。

表1 丙烯酸水溶液電導率

各因素在腈水合酶催化反應中對反應液電導率影響大小分別為：

(1)加入菌體帶入的無機鹽和菌體的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的電導率所占比例為：

176/1102 =16%

(2)生成丙烯酸產(chǎn)生的電導率所占比例為：

[325+(402-325)×(1429-800)/(1200-800)]/1102 = 41%

(3)菌體死亡發(fā)生自溶產(chǎn)生的氨基酸等有機類物質產(chǎn)生的電導率所占比例為：

100%-41%-16% = 43%

因此，當腈水合酶催化反應條件確定后，若要降低反應液電導率，應減少腈水合酶催化反應過程中丙烯酸的生成，即降低腈水合酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)腈水解酶的能力，篩選低產(chǎn)丙烯酸的腈水合酶生產(chǎn)菌株。

2.2 低產(chǎn)丙烯酸腈水合酶生產(chǎn)菌株的篩選

在實際生產(chǎn)過程中，通常按照單菌落的形態(tài)選擇菌株，光滑型的菌落產(chǎn)生腈水解酶的量少，反應液的電導率可由4112 μS·cm-1降低到2725 μS·cm-1[8]。研究發(fā)現(xiàn)，丁烯酰胺對腈水合酶生產(chǎn)菌株具有定向選擇作用，當固態(tài)平板培養(yǎng)基中丁烯酰胺的含量在1%

左右時，多產(chǎn)腈水解酶的菌株能夠存活，而少產(chǎn)腈水解酶的菌株不能存活。利用這一規(guī)律進行定向篩選，從而獲得低產(chǎn)丙烯酸的產(chǎn)腈水合酶菌株，將其用于催化丙烯腈水合反應，測試反應液電導率，結果見表2。

表2 定向選擇菌株對反應液電導率的影響

由表2可知，定向篩選的低產(chǎn)丙烯酸腈水合酶生產(chǎn)菌株能明顯降低反應液的電導率。

3 結論

利用含1%丁烯酰胺的培養(yǎng)基對生產(chǎn)菌株進行定向選擇，可以獲得低產(chǎn)丙烯酸菌株，該類菌株主要產(chǎn)腈水合酶，而產(chǎn)腈水解酶的能力相對低得多。將低產(chǎn)腈水解酶的生產(chǎn)菌株發(fā)酵制得的生物催化劑用于催化丙烯腈水合反應，能顯著降低丙烯酸產(chǎn)量，控制反應液的電導率在500 μS·cm-1以下。

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