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(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系，福建 三明 365004)

草珊瑚(Sarcandraeglabra)又名腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶、竹節(jié)草、鴨腳節(jié)、牛膝頭等，屬于金粟蘭科草珊瑚屬，其味苦、辛、性溫、有小毒，有驅(qū)風(fēng)通絡(luò)、活血祛淤、止血止痛、接骨續(xù)筋之功效，民間常用來治療風(fēng)濕痹癥、跌打損傷等[1～4]，多為全草入藥。臨床上草珊瑚主要用于治療腫瘤、胃潰瘍、細(xì)菌性痢疾、骨折及各種口腔疾病。草珊瑚主要分布在四川、云南、貴州、安徽、福建、江西等地，資源豐富。草珊瑚中含量最多、最主要的藥用成分是黃酮類化合物[4～9]。草珊瑚總黃酮具有抗菌消炎、清熱解毒、抗腫瘤、促進骨折愈合等多種生物活性[6～10]。毒理學(xué)研究表明，草珊瑚及其提取物具有較好的安全性[11]。因此，近年來，草珊瑚活性成分的高效提取一直是國內(nèi)外研究的重要課題。

目前，黃酮類化合物的常規(guī)提取方法主要有冷浸法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、稀醇提取法和微波法。其中微波法具有選擇性高、操作時間短、溶劑消耗少、提取率高、不產(chǎn)生噪音等優(yōu)點，適用于熱不穩(wěn)定生物質(zhì)藥材的提取[12～31]。

本研究采用單因素實驗和正交實驗對三明地區(qū)基因工程選育的草珊瑚總黃酮進行提取,得出最佳的工藝條件，擬為三明地區(qū)基因工程選育的草珊瑚的開發(fā)利用提供有益的參考。

1 實驗

1．1 原料、試劑與儀器

草珊瑚葉片采自福建三明市吉口天然藥物種植基地。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸，分析純；甲醇，色譜純；水為超純水。

LWMC-205型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器，南京陵江科技開發(fā)有限責(zé)任公司；722S型可見分光光度計、FA1604N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計，北京瑞利；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；800型離心沉淀器(4000 r·min-1)，上海手術(shù)器械廠；360型FTIR紅外光譜儀，美國Nicolet公司；1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1．2 方法

1.2.1 草珊瑚總黃酮的提取

精確稱取0.5 g草珊瑚葉片粉末(過120目篩)于錐形瓶中，加入一定量不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇搖勻，將瓶口用保鮮膜覆蓋，浸泡1 h，在一定功率下微波提取一定時間，抽濾，濾液加水定容。

1.2.2 草珊瑚總黃酮的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取10.4 mg已烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為0.104 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長為510 nm。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加60%乙醇至5 mL；各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再各加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；最后各加4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min；在510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。擬合線性回歸方程為：y=1.6894×10-4+0.013175x；R=0.9999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.3 樣品含量的測定

精密吸取提取液1 mL，置于10 mL容量瓶中,按1.2.2.2方法測定吸光度。總黃酮提取率依下式計算：

1.3 表征

1.3.1 紅外光譜分析

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和草珊瑚總黃酮提取物適量，制樣，測定紅外光譜。

1.3.2 顯色反應(yīng)

(1)三氯化鐵反應(yīng):取1 mL提取液于試管中,加1%三氯化鐵乙醇溶液數(shù)滴,振蕩,觀察顏色變化。

(2)三氯化鋁反應(yīng):取提取液點在濾紙上,吹干,滴加1%三氯化鋁乙醇溶液,再吹干,觀察顏色變化。

(3)氫氧化鈉反應(yīng):取1 mL提取液于試管中,加4 mol·L-1氫氧化鈉溶液數(shù)滴,觀察顏色變化,靜置一段時間，再觀察顏色變化。

(4)濃氨水反應(yīng):取提取液點在濾紙上,吹干,將濾紙在濃氨水上方熏0.5 min左右,觀察顏色變化。

1.3.3 高效液相色譜分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇-0.04%磷酸溶液(50∶50,體積比)；檢測波長280 nm；流速0.8 mL·min-1;進樣量5 μL；柱溫35℃。

1.3.3.2 樣品測定

準(zhǔn)確稱取0.1018 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品或0.1018 g草珊瑚總黃酮提取物，用甲醇溶解定容至10 mL，用微量進樣器吸取5 μL進樣分析，記錄色譜峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

在固液比為1∶20(g∶ mL)、微波功率為320 W的條件下，分別選用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇浸泡1 h，微波間歇提取3次，每次30 s?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)對草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取率上升；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，總黃酮提取率最高；但乙醇的體積分?jǐn)?shù)再增大時，總黃酮提取率反而降低。其原因可能與黃酮類化合物的極性有關(guān)，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)可以增強溶劑對物料的滲透性，加大黃酮類化合物的溶解度。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，提取液中會帶入色素及脂溶性物質(zhì)，使得提取率降低。另外，微波加熱時主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，使物料升溫，乙醇體積分?jǐn)?shù)過大會減少料液中水的比例，造成料液升溫減慢，從而影響提取率。

2.1.2 微波功率對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，其它條件不變，考察微波功率對草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 微波功率對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)微波功率小于400 W時，總黃酮提取率隨微波功率的增大而增大，這是由于微波功率增大，加熱效果更好，分子運動加劇，浸出的總黃酮就越多；當(dāng)微波功率超過400 W后，提取液中總黃酮的含量開始下降，這可能是因為大功率產(chǎn)生的強熱效應(yīng)對提取率造成了影響。

2.1.3 固液比對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，其它條件不變，考察固液比對草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 固液比對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，草珊瑚總黃酮的提取率隨固液比的減小相應(yīng)提高，但當(dāng)固液比減小到1∶30時，繼續(xù)增加溶劑的量對總黃酮提取率影響不大。

2.1.4 微波時間對總黃酮提取率的影響

在固液比為1∶20(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為320 W的條件下，分別選用10 s×3、20 s×3、30 s×3、40 s×3、50 s×3的微波加熱時間，考察其對草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 微波加熱時間對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著微波加熱時間的延長，總黃酮提取率不斷增大，但超過30 s×3后提取率開始下降。這可能是由于短時間的微波作用對細(xì)胞膜的破碎作用較大，浸出的總黃酮較多，提取率上升較快；但長時間的微波作用會使提取液溫度過高，可能對總黃酮產(chǎn)生破壞。

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、固液比和微波加熱時間作為考察因素，進行L9(34)正交實驗，實驗因素和水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實驗因素和水平

表2 正交實驗結(jié)果與分析

由表2可以看出，各因素對微波法提取草珊瑚總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波加熱時間>固液比>微波功率。根據(jù)單因素實驗和正交實驗結(jié)果，綜合考慮，確定最佳工藝條件為：60%乙醇、固液比1∶40(g∶ mL)、微波功率400 W、微波加熱時間30 s、間歇加熱3次，此時草珊瑚葉片中總黃酮的提取率為9.394%。

2.3 微波法提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法比較(表3)

表3 微波提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法的比較

從表3可以看出，采用微波法提取草珊瑚總黃酮不但提高了提取率，還大幅縮短了提取時間。

2.4 不同生長期的草珊瑚總黃酮提取率比較

分別選取1年生、2年生、3年生的草珊瑚葉片在最佳條件下提取總黃酮，其提取率分別為9.390%、7.929%、6.023%，草珊瑚中總黃酮含量隨著草珊瑚生長時間的增長而降低,1年生嫩葉片的含量最高。

2.5 提取物的定性分析

2.5.1 紅外光譜(圖6)

圖6 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和草珊瑚總黃酮(b)的紅外光譜圖

圖6中，3427.38 cm-1處為-OH的伸縮振動吸收峰，峰較強，1619.77 cm-1、1443 cm-1處為苯環(huán)的吸收峰。圖6a和圖6b的特征峰基本相似，說明從草珊瑚中提取的總黃酮的成分與蘆丁相似。

2.5.2 顯色反應(yīng)結(jié)果(表4)

表4 顯色反應(yīng)鑒定結(jié)果

2.5.3 高效液相色譜(圖7)

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和草珊瑚總黃酮(b)的高效液相色譜圖

由圖7可知，草珊瑚樣品中的1#峰與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的1#峰保留時間基本一致，可推知1#峰為黃酮類化合物。

3 結(jié)論

(1)通過單因素實驗和正交實驗確定微波法提取草珊瑚總黃酮的最佳條件如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、固液比1∶40(g∶mL)、微波功率400 W、微波加熱時間30 s、間歇作用3次，此時草珊瑚總黃酮的提取率達(dá)到9.394%。

(2)微波法提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法相比，省時、高效、節(jié)能。

(3)草珊瑚中總黃酮含量隨著草珊瑚生長時間的增長而降低,1年生嫩葉片的含量最高。

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