，，

(武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北 武漢 430415)

許多野生食用菌，尤其是草腐菌和菌根菌，都只能培養(yǎng)其菌絲體，卻不能成功地栽培出子實體。因此，對子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究格外重要。

草腐菌子實體的發(fā)生對營養(yǎng)的要求復(fù)雜多樣，且與環(huán)境因子以及環(huán)境微生物的關(guān)系密切，目前少數(shù)報道的草腐菌的子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)實驗，通常是在天然或半合成培養(yǎng)基上進(jìn)行的[1]。由于這些培養(yǎng)基的準(zhǔn)確成分不定，對草腐食用菌生命活動規(guī)律的研究造成了一定的限制。在諸多培養(yǎng)基中，合成培養(yǎng)基因其成分明確，成為培養(yǎng)基設(shè)計初期最好的生理研究和環(huán)境因子篩選平臺。此外，以無機(jī)支持物吸附液體培養(yǎng)基是誘導(dǎo)子實體發(fā)生的較好方法[2]。因此，作者利用珍珠巖吸附液體合成培養(yǎng)基的方法，對紫丁香蘑原基誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基進(jìn)行了成分優(yōu)化，以篩選出一種適于誘導(dǎo)其子實體原基發(fā)生的合成培養(yǎng)基，為進(jìn)一步研究紫丁香蘑的生理學(xué)問題、探討其子實體原基發(fā)生機(jī)理提供實驗平臺。

1 實驗

1.1 菌種

紫丁香蘑(Lepistanuda)子實體采自中國科學(xué)院武漢植物園，取菌肉于PDA培養(yǎng)基[3]上組織分離。無菌檢查后4℃恒溫保藏。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB120 mg，瓊脂 4 g，水1000 mL，10%NaOH調(diào)pH值至6.4[3]。

原基誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基[4～6]：(1)速效碳源(5 g·L-1單/雙糖)，誘導(dǎo)碳源(25 g·L-1多糖)。(2)氮源(2 g·L-1復(fù)合氨基酸)，配制為貯備液使用，每1000 mL培養(yǎng)基添加量78.7 mL，貯備液具體成分：異亮氨酸0.87 g，亮氨酸1.18 g，鹽酸賴氨酸1.74 g，甲硫氨酸1.12 g，苯丙氨酸1.03 g，蘇氨酸1.12 g，色氨酸0.43 g，鹽酸精氨酸3.50 g，纈氨酸0.95 g，甘氨酸3.23 g，鹽酸組氨酸0.98 g，酪氨酸0.165 g，丙氨酸5.33 g，脯氨酸2.90 g，絲氨酸2.90 g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.22 g，谷氨酸2.28 g，蒸餾水1000 mL。(3)無機(jī)鹽(mg·L-1)：KH2PO43000，MgSO4·7H2O 1500，CaCl2·2H2O 40，需將氯化鈣和硫酸鎂分開滅菌后無菌混合。(4)微量元素及鐵鹽：為植物組織培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中MSⅡ微量元素、MSⅢ鐵鹽，MSⅡ貯備液(mg·L-1)：KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025,額外添加：NiCl2·6H2O 0.08，SnCl2·2H2O 0.038;MSⅢ貯備液(mg·L-1)：Na2EDTA 37.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8[7]。(5)生長因子液(mg·L-1)：i-肌醇100，鹽酸硫胺素 0.1，鹽酸吡哆醇 0.5，煙酸 0.5，泛酸鈉 0.1，核黃素 0.1，對氨基苯甲酸0.1，生物素 0.03，葉酸 0.01，氰鈷胺 0.01，需要使用助溶劑并過濾滅菌。(6)刺激出菇的有機(jī)酸鈉鹽(0.1 g·L-1)和子實體發(fā)生刺激物(1×10-5g·L-1)。

1.3 方法

1.3.1 合成培養(yǎng)基初篩及復(fù)篩

合成培養(yǎng)基初篩：選取單/雙糖(5 g·L-1)、子實體發(fā)生刺激物(1×10-5g·L-1)、兩者交互作用、多糖(25 g·L-1)和有機(jī)酸鈉鹽(0.1 g·L-1)分別作為因子A、B、C、D和E， 設(shè)計L16(45)初篩正交實驗，因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基初篩正交實驗因素與水平

合成培養(yǎng)基復(fù)篩：依據(jù)培養(yǎng)基初篩正交實驗的結(jié)果，設(shè)計L9(34)正交實驗進(jìn)行培養(yǎng)基復(fù)篩，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，因素與水平見表2。初篩實驗的最優(yōu)培養(yǎng)基作為復(fù)篩實驗方案之一，可作為參照，因此不另設(shè)對照。

表2 培養(yǎng)基復(fù)篩正交實驗因素與水平

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基支持物：珍珠巖用10%NaOH和10%HCl各浸泡24 h后，蒸餾水洗至中性并浸泡48 h，150℃烘干備用。

培養(yǎng)基配制與滅菌：取10 g珍珠巖裝入250 mL三角瓶中，稱取誘導(dǎo)碳源與珍珠巖攪拌均勻。各培養(yǎng)基成分加入順序依次為速效碳源及有機(jī)酸鈉鹽貯備液、無機(jī)鹽(氯化鈣除外)、MSⅡ貯備液、 MSⅢ貯備液。將三角瓶以一層紗布覆蓋兩層玻璃紙封口，121℃滅菌30 min，冷卻后再加入過濾滅菌的生長因子貯備液、氯化鈣、復(fù)合氨基酸貯備液、子實體發(fā)生刺激物。補足蒸餾水。

1.3.3 種子制備及接種

取紫丁香蘑保藏斜面于25℃下活化48 h后，接入PDA平板中，24℃培養(yǎng)10 d，將培養(yǎng)物剝離瓊脂并以滅菌蒸餾水沖洗3次，勻漿5 s，懸浮于無菌蒸餾水中，立即以破口吸量管吸取1 mL菌絲體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物放置在24℃、80%RH、完全黑暗的條件下培養(yǎng)30 d。待大多數(shù)菌絲長滿培養(yǎng)基表面后，移置16℃、100%RH、60 Lx的條件下，刺激出菇[8]。

1.3.4 子實體原基顯微形態(tài)觀察

以常規(guī)染色檢查原基的顯微結(jié)構(gòu)，憑借其是否具有規(guī)則結(jié)構(gòu)作為與無規(guī)則的菌絲團(tuán)塊結(jié)構(gòu)區(qū)分的依據(jù)[9]，并通過組織化學(xué)染色方法，以普通氣生菌絲為參考，確證在原基及其周邊菌絲中存在糖原的積累，以驗證其是否為子實體原基。原基制片采用石蠟切片法，使用FA固定液，切片厚度10 μm，瑞氏染色劑染色后脫水，透明，以甘油膠凍封片[10]，鏡檢。糖原檢測采用過碘酸-Schiff氏染色法[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 原基結(jié)構(gòu)

35 d左右，原始原基結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)于容器壁上，肉眼觀察呈白色的球狀或半球狀，直徑0.5～4 mm。質(zhì)地疏松，透過燈光可以發(fā)現(xiàn)其中有暗色致密的核心，繩索狀菌絲貫穿或附于其上。

在低倍鏡下可見原基的縱切面與橫切面都由大量分支菌絲構(gòu)成且明顯分為3層，外層的疏松菌絲包圍著內(nèi)層較致密的菌絲，核心是扭結(jié)在一起的深色菌絲。扭結(jié)的核心伸出一條或數(shù)條菌絲索狀結(jié)構(gòu)。任何層次的菌絲都具有多量索狀聯(lián)合。圖1為6#復(fù)篩培養(yǎng)基培養(yǎng)的子實體放大600倍的顯微結(jié)構(gòu)，圖片右下角為手繪結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1 子實體半球狀原基的顯微照片

僅從形態(tài)上來說，此結(jié)構(gòu)與李榮春[12]以低溫掃描電鏡觀察雙孢蘑菇原基起源點結(jié)構(gòu)十分類似，是紫丁香蘑的原基或原基起源點。組織化學(xué)檢查在此結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了糖原的存在；生長在PDA培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基尚未產(chǎn)生原基的菌絲中沒有大量的糖原。由于缺乏定量的檢測手段，不能衡量二者的差異。

2.2 培養(yǎng)基初篩及復(fù)篩實驗結(jié)果

經(jīng)過30 d的24℃恒溫?zé)o光培養(yǎng)和15 d的出菇刺激，各培養(yǎng)基初篩結(jié)果見表3、表4。

表3 培養(yǎng)基初篩正交實驗結(jié)果與分析

表4 培養(yǎng)基初篩正交實驗結(jié)果方差分析

從表3、表4可知，最優(yōu)培養(yǎng)基為A2B1D3E4(5#)或A2B2D3E4，與Hayes等[14]的雙孢蘑菇子實體誘導(dǎo)培養(yǎng)基非常接近。就各因子的影響程度而言，D>A >C>B=E，且只有因子D的影響達(dá)到了顯著水平，可以看出多糖很可能是誘導(dǎo)子實體原基發(fā)生的決定性因素[15]。雙孢蘑菇的菌絲體營養(yǎng)生長和生殖生長的碳源是木質(zhì)素和纖維素，而紫丁香蘑菌絲體營養(yǎng)生長和生殖生長的最適碳源是淀粉[16]和糊精，二者相差很大。本研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)磷腺苷和茶堿對紫丁香蘑子實體原基的誘導(dǎo)并沒有特殊影響。邱龍新[17]對灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)的研究中，在培養(yǎng)基中添加環(huán)磷腺苷(cAMP)并不能誘導(dǎo)菌絲體產(chǎn)生原基和子實體，這說明cAMP不是鬼傘雙核體菌絲生長和子實體形成所必需的直接信號，因此，復(fù)篩中為節(jié)約成本不再添加子實體發(fā)生刺激物。

培養(yǎng)基復(fù)篩實驗所有組合經(jīng)過30 d、24℃的無光培養(yǎng)，再經(jīng)過15 d出菇刺激，開始出現(xiàn)原基。結(jié)果見表5、表6。

表5 培養(yǎng)基復(fù)篩正交實驗結(jié)果與分析

表6 培養(yǎng)基復(fù)篩正交實驗結(jié)果方差分析

其它的因子在方差分析中效應(yīng)均不明顯，其中乙酸鈉的效應(yīng)盡管在方差分析中不顯著，但仍與Hayes的研究結(jié)果一致。雖然培養(yǎng)基中沒有添加環(huán)磷腺苷或茶堿，但仍然有多量的子實體原基發(fā)生，可見邱龍新和Wood[2]的結(jié)論對紫丁香蘑一樣適用。

本次實驗并沒有觀察到所誘導(dǎo)出的原基繼續(xù)發(fā)育為子實體，盡管從接種到培養(yǎng)結(jié)束的時間已經(jīng)大大超過在人工栽培條件下紫丁香蘑由菌絲體發(fā)育為完整子實體的時間(60 d)。這個問題有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

篩選出用于紫丁香蘑原基誘導(dǎo)的合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基由復(fù)合碳源(木糖+糊精)、復(fù)合氨基酸氮源、無機(jī)鹽、MS培養(yǎng)基中的微量元素及鐵鹽、生長因子、出菇刺激物等6部分構(gòu)成，以珍珠巖為支持物。優(yōu)化后培養(yǎng)基中含有5 g·L-1木糖、25 g·L-1糊精、0.1 g·L-1乙酸鈉。在此培養(yǎng)基上，紫丁香蘑菌絲經(jīng)24℃無光培養(yǎng)30 d、再經(jīng)16℃弱光刺激15 d后可產(chǎn)生83個原基。紫丁香蘑菌絲體營養(yǎng)生長和生殖生長的最適碳源是淀粉和糊精。菌絲體營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的過程中，多糖起了決定性的作用，是誘導(dǎo)子實體原基形成的關(guān)鍵因素，而cAMP并不是雙核體菌絲生長和子實體形成所必需的直接信號。

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