近年來(lái)二肽已成為藥物、保健食品、食品添加劑工業(yè)的研發(fā)新熱點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。例如二肽經(jīng)甲酯化和環(huán)化后生成哌嗪二酮衍生物，多種哌嗪二酮類化合物對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有特異性抑制作用[1]，可篩選為潛在的抗腫瘤藥物。目前，二肽合成多采用化學(xué)法，但是化學(xué)法合成二肽要求有保護(hù)和活化步驟，反應(yīng)步驟長(zhǎng)、副產(chǎn)物多[2]。利用酶作為催化劑合成二肽的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)品質(zhì)量高，對(duì)環(huán)境友好，因而受到廣泛重視且部分品種已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。如荷蘭DSM公司和日本Tova Soda公司利用蛋白酶大規(guī)模合成增甜劑阿斯巴甜，目前年生產(chǎn)能力在1萬(wàn) t左右[3]。雖然蛋白酶被成功用于二肽合成，但其只能選擇性合成L-氨基酸衍生物，而不能轉(zhuǎn)化非天然氨基酸如D-苯甘氨酸[4]。

青霉素酰化酶是半合成抗生素生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，可以合成眾多的β-內(nèi)酰胺抗生素[5,6]。此外，該酶在手性合成物拆分與合成方面也應(yīng)用廣泛[7,8]。Khimiuk等[2]發(fā)現(xiàn)E.coli來(lái)源的青霉素G?；?Penicillin G acylase,PGA) 可用于酶法合成非天然的苯甘氨酸二肽,其合成過(guò)程如圖1所示[2]。

圖1 青霉素G酰化酶催化合成二肽

由于A.faecalis來(lái)源的 PGA在底物選擇性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9,10]，催化性能優(yōu)于E.coliPGA,因此，作者采用A.faecalisPGA的固定化重組細(xì)胞作為催化劑合成D-苯甘氨酸二肽，擬為其規(guī)?；阜ㄉa(chǎn)打下良好基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑和儀器

產(chǎn)A.faecalisPGA的重組E.coli菌株由中國(guó)科學(xué)院袁中一研究員提供。

L-亮氨酸、L-異亮氨酸，生物純，上海求德生物化工有限公司；L-組氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸，生物純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；D-苯甘氨酰胺(純度>99%)，浙江天臺(tái)藥業(yè)。

1100 Series型高效液相色譜儀，Agilent 公司；722S型可見分光光度計(jì)，上海菁華；HZ-8212S型恒溫振蕩水浴，華利達(dá)；自動(dòng)控溫控pH值的酶催化反應(yīng)裝置，自制。

1.2 方法

1.2.1 菌體細(xì)胞通透處理

離心收集細(xì)胞，在磷酸緩沖溶液(50 mmol·L-1，pH值7.8)中重懸浮。加入一定量的溴化十六烷基三甲基氯化銨(CTAB)，在攪拌條件下處理細(xì)胞。離心，去除上清液，得滲透處理的細(xì)胞。

1.2.2 重組細(xì)胞固定化

取處理的細(xì)胞懸浮于Tris-HCl緩沖溶液中(50 mmol·L-1,pH值8.0)，在37℃下依次加入10 mL 5% 海藻酸鈉及10 mL 15%聚乙烯醇，混合。將混勻物逐滴滴入含5% CaCl2的冷飽和硼酸溶液中，在4℃靜置72 h。抽濾去除硼酸溶液，用Tris-HCl緩沖溶液清洗幾次。

包埋細(xì)胞和終濃度2%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛在4℃ 下交聯(lián)反應(yīng)6 h，然后用Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol·L-1,pH值8.0)清洗幾次，即得固定化細(xì)胞。

1.2.3 生物催化合成二肽

取50 mmol·L-1的D-苯甘氨酰胺和65 mmol·L-1的L-氨基酸，調(diào)pH值9.5，定容至20 mL，加入5 g固定化細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，控制反應(yīng)溫度為25℃、pH值為9.5。在反應(yīng)不同階段定時(shí)取樣，參照Khimiuk等[2]方法用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程及各物質(zhì)的含量。反應(yīng)完畢，過(guò)濾去除固定化細(xì)胞，加入2 mol·L-1的H2SO4調(diào)pH值至5.0。靜置12 h，二肽逐漸沉淀析出，過(guò)濾，得目的產(chǎn)物。

反應(yīng)液通過(guò)裝有XDB-C18柱的Agilent 1100系列HPLC液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)。流動(dòng)相：含40%(體積分?jǐn)?shù)) 乙腈、0.7 g·L-1SDS的磷酸溶液(pH值3.5)，流速1.0 mL· min-1，柱溫 20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm。

1.2.4 酶活測(cè)定

酶活的測(cè)定采用PDAB法[11]：稱取一定量的固定化細(xì)胞，在37℃下預(yù)熱5 min，加入預(yù)熱的4%青霉素G鉀鹽溶液5 mL。反應(yīng)5 min后立即取0.5 mL于空白試管中，加入3.5 mL PDAB顯色液顯色5 min，在415 nm下比色測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞通透處理及固定化載體選擇

由于青霉素G?；冈诖竽c桿菌中主要位于細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)[12]，要提高固定化細(xì)胞的酶活性需先進(jìn)行重組細(xì)胞通透處理，以減少細(xì)胞對(duì)酶的擴(kuò)散限制。CATB可作用于大腸桿菌細(xì)胞的脂質(zhì)和磷脂層[13]，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而增加細(xì)胞的通透性。通過(guò)優(yōu)化CTAB處理?xiàng)l件，在0.3%(質(zhì)量體積比)CTAB、25℃、處理75 min的條件下，細(xì)胞通透性增加了7.5倍。

不用戊二醛交聯(lián)的聚乙烯醇固定化細(xì)胞酶活雖較高[21.8 U·(g濕載體)-1]，但在堿性反應(yīng)條件下穩(wěn)定性較差，批反應(yīng)次數(shù)較少。采用戊二醛交聯(lián)聚乙烯醇固定化細(xì)胞雖酶活降低約1/3，但是固定化細(xì)胞穩(wěn)定性好、硬度高，形成多空顆粒，且細(xì)胞大小基本相同，呈規(guī)則的球形。在pH值10、50℃下催化青霉素G鉀鹽的重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)中，每150 min為一批次，使用15批次基本沒有酶失活，重復(fù)31批次后仍保留65%的酶活，37批次后仍有較好的彈性和較高的硬度[14]。此外，還嘗試了采用海藻酸鈉固定法及海藻酸鈉-明膠交聯(lián)法固定細(xì)胞，獲得的催化劑在硬度、穩(wěn)定性等方面均相對(duì)較差。

2.2 HPLC檢測(cè)方法的建立

產(chǎn)物形成過(guò)程均采用HPLC方法監(jiān)測(cè)，大多可形成4個(gè)有規(guī)律的峰。以D-Phenylglyl-L-isoleucine為例，其HPLC圖譜見圖2。

Ⅰ.D-Phenylglycine Ⅱ.L-Isoleucine Ⅲ.D-Phenylglycine amide Ⅳ.D-Phenylglyl-L-isoleucine

反應(yīng)過(guò)程中各物質(zhì)的保留時(shí)間見表1。

表1 HPLC分析中各物質(zhì)的保留時(shí)間/min

2.3 二肽合成反應(yīng)過(guò)程解析

由于D-苯甘氨酰胺本身就是青霉素G?；傅乃獾孜铮苑磻?yīng)系統(tǒng)中除了D-苯甘氨酰胺與L-氨基酸生成二肽的合成反應(yīng)外，還存在D-苯甘氨酰胺自身被酶水解生成D-苯甘氨酸和氨氣的反應(yīng)以及合成的二肽被酶水解的反應(yīng)，故整個(gè)反應(yīng)中D-苯甘氨酸為主要反應(yīng)副產(chǎn)物，應(yīng)盡量避免該副產(chǎn)物的形成。在此，為減少D-苯甘氨酰胺的水解，采用L-氨基酸底物過(guò)量的方法。

以D-苯甘氨酰胺為固定底物，利用固定化A.faecalisPGA重組細(xì)胞為催化劑，選取不同L-氨基酸進(jìn)行二肽合成實(shí)驗(yàn)，其中幾種效果較好二肽的合成過(guò)程見圖3。

a.D-Phenylglyl-L-glycine b.D-Phenylglyl-L-isoleucine c.D-Phenylglyl-L-alanine

d.D-Phenylglyl-L-glutamic acid e.D-Phenylglyl-L-histidine f.D-Phenylglyl-L-leucine

圖3 固定化重組細(xì)胞催化合成二肽的過(guò)程圖

由圖3可以看出，采用固定化A.faecalisPGA重組細(xì)胞催化合成二肽時(shí)，反應(yīng)速度較快。在相同反應(yīng)條件下，反應(yīng)15 min時(shí)，除D-Phenylglyl-L-glycine的濃度為10.39 mmol·L-1(液相得率20%)外，其余5種二肽的濃度均超過(guò)25 mmol·L-1，即液相得率超過(guò)了50%。

整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中,主要副產(chǎn)物D-苯甘氨酸生成的過(guò)程曲線大致相似，開始時(shí)由于參加二肽合成的L-氨基酸濃度較高，酶主要催化二肽合成反應(yīng)，故副產(chǎn)物D-苯甘氨酸的生成量較少;隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，游離的L-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)二肽而濃度變小，進(jìn)而D-苯甘氨酰胺的水解反應(yīng)速度加快，副產(chǎn)物D-苯甘氨酸濃度逐漸加大。因此,在選取固定底物D-苯甘氨酰胺與游離L-氨基酸的摩爾比時(shí)，加大游離L-氨基酸摩爾量 [理論上n(D-苯甘氨酰胺)∶n(氨基酸)=1∶1.5]可使D-苯甘氨酰胺盡可能多地參加二肽合成反應(yīng)，在一定程度上減少副產(chǎn)物D-苯甘氨酸的生成。

由圖3還可以看出，二肽合成與副產(chǎn)物D-苯甘氨酸生成存在一定的關(guān)系，6種非天然二肽獲得最大生成量的時(shí)間均在反應(yīng)6 h左右。當(dāng)達(dá)到最大產(chǎn)物量后，產(chǎn)率穩(wěn)定持續(xù)一段時(shí)間或開始逐漸下降。相對(duì)應(yīng)的，副產(chǎn)物D-苯甘氨酸的生成量開始逐漸加大。當(dāng)二肽合成獲得最大得率時(shí)，副產(chǎn)物D-苯甘氨酸的得率均為5 mmol·L-1左右，相當(dāng)于10%的D-苯甘氨酰胺參加了水解反應(yīng)。

Khimiuk等[2]認(rèn)為在副產(chǎn)物D-苯甘氨酸濃度10%左右終止反應(yīng)較為合適。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-苯甘氨酸濃度在10%左右時(shí)，雖可獲得最大二肽得率，但反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(6 h)。鑒于二肽合成反應(yīng)初期速率較快、副產(chǎn)物D-苯甘氨酸較少，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，作者認(rèn)為終止反應(yīng)的時(shí)間在60 min左右較為合適，此時(shí)D-苯甘氨酸量少，易與目的產(chǎn)物分離。

青霉素G?；傅孽；B接位點(diǎn)對(duì)苯乙酸及其衍生物有高度選擇性，也可以接受苯甘氨酸派生物作為?；w。相反地，其親核連接端對(duì)大部分氨基酸的L-異構(gòu)體具有廣泛的選擇性，因此，青霉素G?；冈诤铣蒁-苯甘氨酸二肽方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2,3]。

2.4 二肽合成的結(jié)果比較

二肽合成的最高液相得率、實(shí)際產(chǎn)品分離率、反應(yīng)后殘余酶活(20 h)比較見表2。

表2 二肽合成的結(jié)果比較/%

由表2可以看出，6種二肽合成過(guò)程獲得的最高液相得率較高，均超過(guò)80%，D-Phenylglyl-L-histidine的液相得率甚至超過(guò)90%。將反應(yīng)溶液的pH值降至5.5左右時(shí)，雖然產(chǎn)物逐漸析出，但是過(guò)濾干燥后稱量發(fā)現(xiàn)其實(shí)際的產(chǎn)品分離率均不高，其中最高的D-Phenylglyl-L-glycine二肽的實(shí)際產(chǎn)品分離率僅43%，近一半的二肽仍然在反應(yīng)溶液中沒有析出。D-Phenylglyl-L-histidine二肽的實(shí)際產(chǎn)品分離率僅為19%，還有大約72%的產(chǎn)品沒有析出。

綜上所述，雖然固定化A.faecalisPGA重組細(xì)胞催化合成二肽具有反應(yīng)速度快、液相得率較高的優(yōu)勢(shì)，但是產(chǎn)品的實(shí)際分離率相對(duì)較低,產(chǎn)品的分離方法還有待深入研究。

由表2還可以看出，反應(yīng)完畢后酶活丟失較少，酶活丟失最多的D-Phenylglyl-L-glutamic acid二肽合成反應(yīng)，殘余酶活為85%，表明固定化細(xì)胞可重復(fù)使用。Shcherbakova等[15]發(fā)現(xiàn)E.coliPGA在高苯甘氨酰胺濃度下嚴(yán)重失活，苯甘氨酰胺濃度為100 mmol·L-1、反應(yīng)100 min時(shí)，殘余酶活僅為25%左右。而以A.faecalisPGA為催化劑，同樣反應(yīng)條件下的殘余酶活在62%左右，表明A.faecalisPGA在二肽合成方面比E.coliPGA具有更高的底物穩(wěn)定性，應(yīng)用潛力較好。

3 結(jié)論

選取具有代表性的6種L-氨基酸作為酰基受體，以D-苯甘氨酰胺作為酰基供體，采用固定化A.faecalisPGA重組細(xì)胞進(jìn)行催化二肽合成的研究。結(jié)果表明，催化反應(yīng)的速度較快，除D-Phenylglyl-L-glycine二肽開始時(shí)反應(yīng)速率稍慢(15 min時(shí)液相得率20%) 外，其余幾種二肽的合成在反應(yīng)15 min時(shí)液相得率均超過(guò)50%。合成的二肽基本在反應(yīng)6 h時(shí)得到最高液相產(chǎn)率，均超過(guò)80%。雖然反應(yīng)過(guò)程獲得的液相得率較高，但實(shí)際產(chǎn)品分離率并不高,關(guān)于產(chǎn)品的分離純化方法還有待繼續(xù)進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hasinoff B B,Kuschak T I,Yalowich J C,et al.A QSAR study comparing the cytotoxicity and DNA topoisomerase Ⅱ inhibitory effects of bisdioxopiperazine analogs of ICRF-187(dexrazoxane)[J].Biochem Pharmacology,1995,50(7):953-958.

[2] Khimiuk A Y,Korennykh A V,van Langen L M,et al.Penicillin acylase-catalyzed peptide synthesis in aqueous medium:A chemo-enzyme route to steroisomerically pure diketopiperazines[J].Tetrahedron：Asymmetry,2003,14(20)：3123-3128.

[3] Liese A,Seelbach K,Wandrey C.Industrial Biotransformations (2nd)[M].Wiley-VCH，2006：320-322.

[5] Wei D Z,Liu Y.Effects of ethylene glycol on the synthesis of ampicillin using immobilized penicillin G acylase[J].J Chem Technol Biot,2003,78(4)：431-436.

[6] Liu Y,Wei D Z,Zhang Y W.Semi-continuous enzymatic synthesis of cefaclor enhanced by in situ product removal[J].J Chem Technol Biot,2004,79(5)：480-485.

[7] Guranda D T,Khimiuk A K,van Langen L M,et al.An′easy-on,easy-off′protecting group for the enzymatic resolution of(±)-1-phenylethylamine in an aqueous medium[J].Tetrahedron ：Asymmetry,2004,15(18)：2901-2906.

[8] Rocchietti S,Urrutia A S V,Pregnolato M,et al.Influence of the enzyme derivative preparation and substrate structure on the enantioselectivity of penicillin G acylase[J].Enzyme Microb Technol，2002,31(1-2)：88-93.

[9] Verhaeart R M D,Riemins A M.Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase fromAlacaligenesfaecalis[J].Appl Environ Microb，1997,63(9)：3412-3418.

[10] van Langen L M,Oosthoek N H P,Guranda D T,et al.Penicillin acylase-catalyzed resolution of amines in aqueous organic solvents[J].Tetrahedron:Asymmetry，2000,11(22)：4593-4600.

[11] Shewale J G,Kumar K K,Ambekar G R.Evaluation of determination of 6-amino penicillanic acid byp-dimethylaminobenzadehyde[J].Biotechnol Tech，1987,1(1)：69-72.

[12] Chou C P,Yu C C,Tseng J H,et al.Genetic manipulation to identify limiting steps and develop strategies for high-level expression of penicillin acylase inEscherichiacoli[J].Biotechnol Bioeng，1999,63(3)：263-272.

[13] Mutalik R B,Gaikar V G.Cell permeabilization for extraction of penicillin acylase fromEscherichiacoliby reverse micellar solutions[J].Enzyme Microb Technol，2003,32(1)：14-26.

[14] Cheng S W,Wei D Z,Song Q X,et al.Immobilization of permeabilized whole cell penicillin G acylase fromAlcaligenesfaecalisusing pore matrix crosslinked with glutaraldehyde[J].Biotechnol Lett，2006,28(14)：1129-1133.

[15] Shcherbakova T A,Korennykh A V,van Langen L M,et al.Use of high acyl donor concentrations leads to penicillin acylase inactivation in the course of peptide synthesis[J].J Mol Catal B-Enzym，2004,31(1-3):63-65.