近年來(lái),全世界對(duì)能源的需求量急劇增加，加速了對(duì)有限的不可再生礦物能源的消耗。因此，可再生的、清潔的生物質(zhì)能成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其中燃料乙醇工業(yè)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展，而以大量木質(zhì)纖維素生物質(zhì)材料為基礎(chǔ)的燃料乙醇行業(yè)更是熱點(diǎn)中的焦點(diǎn)[1]。

迄今較成熟的燃料乙醇的生物轉(zhuǎn)化方法是以玉米、小麥等糧食為原料，但其原料成本高昂，同時(shí)受到人口增加和耕地減少的限制。而貯存于作物秸稈中的木質(zhì)纖維素來(lái)自植物的光合作用，是地球上可用于生產(chǎn)生物燃料最豐富、最廉價(jià)的可再生資源[2]，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇是降低燃料乙醇生產(chǎn)成本的根本出路。巴西、瑞典、日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家正在推行可再生纖維素原料酶水解生產(chǎn)乙醇的能源計(jì)劃。已研究出30多套植物纖維原料酶水解技術(shù)路線(xiàn)，有的達(dá)到相當(dāng)大的實(shí)驗(yàn)工廠生產(chǎn)規(guī)模。目前，國(guó)內(nèi)外秸稈乙醇生產(chǎn)工藝已經(jīng)打通，但成本太高。

木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障，使酶不易與纖維素分子接觸，而木質(zhì)素的非水溶性及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致了秸稈的難降解性。因此,要徹底降解纖維素，提高秸稈的降解性能，必須首先解決木質(zhì)素的降解問(wèn)題[3]。

由于木質(zhì)纖維原料致密復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及纖維素分子高度結(jié)晶的特性，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以降低纖維素的結(jié)晶度，增加纖維原料的多孔性，脫除木質(zhì)素的保護(hù)作用，增加酶與底物的接觸面積，從而提高酶解的效率[4]。采用的預(yù)處理方法應(yīng)滿(mǎn)足以下要求：(1)有利于酶水解過(guò)程的糖化；(2)避免碳水化合物的降解或損失；(3)避免生成對(duì)后續(xù)水解或發(fā)酵有害的副產(chǎn)物；(4)經(jīng)濟(jì)可行。預(yù)處理方法歸納起來(lái)包括蒸汽爆破法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法等[5]。這些方法要做到經(jīng)濟(jì)可行卻很不容易[6,7]。

在木質(zhì)素生物降解過(guò)程中真菌起主要作用，而細(xì)菌主要是使木質(zhì)素在一定程度上發(fā)生變性，成為水溶性的聚合物。對(duì)木質(zhì)素有降解作用的細(xì)菌主要有厭氧梭菌、 不動(dòng)桿菌、 黃桿菌、 微球菌、 假單胞菌、 雙芽孢桿菌、 黃單胞菌、 枝動(dòng)桿菌等。真菌主要有三種：白腐菌、 褐腐菌、 軟腐菌。其中白腐真菌的降解能力最強(qiáng)，開(kāi)發(fā)利用前景較好。近年來(lái)，研究也發(fā)現(xiàn)了一些非常規(guī)降解菌種，如Elenasláviková發(fā)現(xiàn)的一株酵母菌(Trihosporonpullulans)對(duì)木質(zhì)素有較好的降解能力[8]。

天牛是鞘翅目昆蟲(chóng)中一個(gè)很大的類(lèi)群，其大多以木質(zhì)纖維材料為食，如林木、果樹(shù)、桑、茶、棉、竹、木建材料等。早在20世紀(jì)初，天牛分解利用纖維素的研究便已開(kāi)始[9]。作者以桑粒肩天牛(Apironagermari)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的腸道為材料，篩選木質(zhì)纖維素分解菌，從中發(fā)掘新的資源微生物和功能微生物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

供試?yán)ハx(chóng)：桑粒肩天牛(Aprionagermari)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)，采于湖北省公安縣，寄主植物為楊樹(shù),實(shí)驗(yàn)前斷食1 d,排除體內(nèi)食物殘?jiān)?/p>

1.2 培養(yǎng)基

纖維素-剛果紅選擇培養(yǎng)基：(NH4)2SO44.3 g,MgSO40.25 g,KH2PO40.5 g,CaCl20.3 g,纖維素粉1.88 g,瓊脂 18 g,剛果紅0.2 g,蒸餾水1000 mL。

苯胺藍(lán)(Azure-B)培養(yǎng)基:木質(zhì)素10 g，(NH4)2SO44.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO44.3 g，CaCl20.3 g，苯胺藍(lán)0.1 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。

纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，(NH4)2SO44 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，蒸餾水1000 mL。調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，121℃滅菌30 min。

木質(zhì)素發(fā)酵培養(yǎng)基：木質(zhì)素10 g，蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2O 3 g，KH2PO43 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL。調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，121℃滅菌30 min。

1.3 菌株篩選方法

剪去桑粒肩天牛成蟲(chóng)觸角、翅和足，用75%酒精浸泡3 min，解剖，取其腸道，用細(xì)線(xiàn)將腸道分前中腸、后中腸、后腸系緊,將這3部分剪開(kāi)，分別置于裝有10 mL無(wú)菌水的離心管中，充分振蕩，稀釋度至10-6級(jí)。

取不同稀釋度的樣品接種于纖維素-剛果紅培養(yǎng)基，分別置于37℃、28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)紅色培養(yǎng)基變色程度、水解圈大小，挑選單菌落至以CMC-Na為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中復(fù)篩，觀察菌落生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落的生長(zhǎng)速度及CMC-Na的液化程度選出纖維素分解能力較好的菌株。

取不同稀釋度的樣品接種于以木質(zhì)素為碳源的培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d。將平板置于白色背景下，觀察有無(wú)透明圈(有透明圈表示木質(zhì)素被降解)。挑取單菌落至含苯胺藍(lán)培養(yǎng)基平板中，25℃避光培養(yǎng)10 d，每天觀察記錄，以苯胺藍(lán)培養(yǎng)基中菌落的脫色圈的有無(wú)及產(chǎn)生快慢和脫色圈的大小定性篩選出產(chǎn)酶快、酶活高的菌株。

1.4 菌種鑒定

參照李阜隸等[10]的方法分離、挑選細(xì)菌、革蘭氏染色和芽孢染色。生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[11]。

1.5 酶活測(cè)定

纖維素降解酶活性測(cè)定：DNS法；錳過(guò)氧化物酶(Mnp)活性的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[12]；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)活性的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[13]；漆酶(Lac)活性的測(cè)定：以愈創(chuàng)木酚為底物，3 mL反應(yīng)體系中含50 mmol·L-1(pH值4.5)的乳酸鈉緩沖溶液 1.6 mL、0.5 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚0.4 mL、酶液1.0 mL，30℃反應(yīng)3 min后于485 nm測(cè)定吸光度。1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選分離

利用纖維素-剛果紅選擇培養(yǎng)基和苯胺藍(lán)(Azure-B)培養(yǎng)基，從桑粒肩天牛腸道內(nèi)篩選出5株在兩種培養(yǎng)基上均有明顯水解圈的菌株。說(shuō)明菌株對(duì)纖維素和木質(zhì)素都有降解作用，可能其表達(dá)的各種酶系的協(xié)同作用較強(qiáng),對(duì)木質(zhì)纖維素底物作用能力較強(qiáng)。挑選兩種培養(yǎng)基上水解圈最大的菌株C5進(jìn)行下一步的研究。

2.2 菌株的鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色的顯微觀察結(jié)果，從不同特征的分離株中得到菌株的菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征見(jiàn)表1。

表1 菌落形態(tài)特征

對(duì)菌株C5進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生理生化鑒定結(jié)果

綜合表1、表2結(jié)果，參考伯杰士細(xì)菌分類(lèi)手冊(cè)和常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[11],基本確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

2.3 纖維素酶活的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察C5的產(chǎn)纖維素酶效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，纖維素酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。48 h時(shí)，酶活為0.49 IU· mL-1，72 h時(shí)，纖維素酶活最大，為0.51 IU· mL-1。36 h時(shí)菌濃達(dá)到最大為2.35×107cfu· mL-1，表明C5菌產(chǎn)生纖維素酶基本上和菌體的生長(zhǎng)同步。

2.4 木質(zhì)素酶活的測(cè)定結(jié)果

木質(zhì)素降解酶主要有 3 種:木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)、錳過(guò)氧化物酶(Mnp)和漆酶(Lac)，但并不是每種菌都能產(chǎn)生這3 種酶。Lip是一種來(lái)源于真菌的過(guò)氧化物酶，是降解木質(zhì)素的過(guò)氧化物酶系的主要成分[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C5的發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到Lip的活力，這可能和細(xì)菌的特性有關(guān)，該菌可能不產(chǎn)Lip，基本上和文獻(xiàn)報(bào)道的Lip主要存在于真菌中的結(jié)論相符[12]。木質(zhì)素酶活的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 木質(zhì)素酶活測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，Mnp在96 h達(dá)到最大值0.1841 IU· mL-1。Lac酶活在48 h就達(dá)到最大值0.0633 IU· mL-1，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Lac酶活呈下降趨勢(shì)，可能在后期的生長(zhǎng)中，產(chǎn)生了該酶的抑制劑或被分解。

3 結(jié)論

從桑粒肩天牛腸道中篩選得到了1株具有降解纖維素和木質(zhì)素能力的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。通過(guò)平板和液體發(fā)酵驗(yàn)證，基本上可以確定其具有降解木質(zhì)素的酶活，特別是錳過(guò)氧化物酶的活力和漆酶的活力較高。該菌株同時(shí)具有降解纖維素和木質(zhì)素的作用，為木質(zhì)纖維素材料的降解提供了重要資源，對(duì)進(jìn)一步研究木質(zhì)纖維素材料的轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張輝，朱奇，戴傳超，等.生物降解木質(zhì)素研究新進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(9)：1780-1784.

[2] Pérez J A,Ballesteros I,Ballesteros M,et al.Optimizing liquid hot water pretreatment conditions to enhance sugar recovery from wheat straw for fuel-ethanol production[J].Fuel,2008,87(17-18)：3640-3647.

[3] Zhang L H,Li D,Wang L J,et al.Effect of steam explosion on biodegradation of lignin in wheat straw[J].Bioresource Technology,2008,99(17)：8512-8515.

[4] Hendriks A T W M,Zeeman G.Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass[J].Bioresource Technology,2009,100(1)：10-18.

[5] Sánchez O J,Cardona C A.Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks[J].Bioresource Technology,2008,99(13)：5270-5295.

[6] Deka Manabendra,Saikia C N,Baruah K K.Studies on thermal degradation and termite resistant properties of chemically modified wood[J].Bioresource Technology,2002,84(2)：151-157.

[7] Ballesteros Ignacio,Ballesteros Mercedes,Manzanares Paloma,et al.Dilute sulfuric acid pretreatment of cardoon for ethanol production[J].Biochemical Engineering Journal,2008,42(1)：84-91.

[8] 陳立祥，章懷云.木質(zhì)素生物降解及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23(1)：79-85.

[9] 曹月青，殷幼平，何正波，等.桑粒肩天牛腸道纖維素分解菌的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2001，28(1)：1-6.

[10] 李阜隸，喻子牛，何紹江.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：22-102.

[11] 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2005：112-350.

[12] Glenn J K,Gold M H.Effect of various media and supplements on production by some white rot fungi[J].Bioresource Technology,2001,77(1)：89-91.

[13] Archibald Frederick S.A new assay for lignin-type per-oxidase employing in the dye Azure：B[J].Applied and Environmental Microbiology,1992,58(9):3110-3116.

[14] Kuwhaar M,Glenn J K，Morgan M A.Separation and characterization of two extracellular hydrogen peroxide-dependent oxidases from ligninolytic cultures ofPhanetochaetechrysosporium[J].FEBS Lett,1984,169(2)：247-250.