馮冬茹, 王宏斌, 劉 兵, 何炎明, 戚康標(biāo),王金發(fā)

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥基因工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

低溫是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育及其地理分布的重要環(huán)境因素之一，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害[1]。許多植物經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的非致死低溫作用后,抵抗低溫的能力得以增強(qiáng),這種現(xiàn)象稱為冷馴化(cold acclimation,CA)[2]。植物對(duì)低溫脅迫的馴化涉及特定冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而抵御低溫傷害。不同的植物對(duì)低溫誘導(dǎo)的響應(yīng)各有不同,不同基因型決定了植物不同的抗寒性[3]。

香蕉Musaspp.作為最大宗的高效益熱帶作物，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占舉足輕重的地位，但是，由于春冬季的寒潮入侵而出現(xiàn)不同程度的寒害，產(chǎn)量大大下降。其中風(fēng)味佳、種植量大的香牙蕉(MusananaLour.， AAA 群，常簡(jiǎn)稱香蕉)受害最重，而大蕉(MusaparadisiacaL.，ABB 群)則受害較輕，具有明顯的抗寒性。1999年12月湛江遭受了幾十年一遇的冷害，有的地區(qū)溫度低達(dá)2 ℃左右，香蕉(AAA群)葉片全部被凍死，大蕉雖有一定程度受害，但寒流過(guò)后，很快恢復(fù)；在4 ℃以上的地區(qū)，大蕉受影響不大，而香蕉(AAA群)大部分葉片則受凍變黃，甚至枯萎。呂慶芳等[4]發(fā)現(xiàn)大蕉的葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度比香蕉的高，耐寒性也比香蕉強(qiáng)。通過(guò)SDS-PAGE圖譜分析表明抗冷性較強(qiáng)的大蕉(ABB群)能在相對(duì)較高的低溫(如10 ℃)下開(kāi)始接受低溫的誘導(dǎo)，從而更能忍耐低溫的脅迫[5]。通過(guò)分析大蕉低溫下基因表達(dá)的變化來(lái)分離抗寒相關(guān)基因并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)研究，既探索植物抗寒性的遺傳機(jī)理，又為開(kāi)發(fā)基因資源和香蕉(AAA群)等經(jīng)濟(jì)作物的遺傳改良提供有用的基因，這不僅在基礎(chǔ)理論上具有重要意義，還具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實(shí)驗(yàn)用的大蕉(MusaparadisiacaL.，ABB 群)采自廣東省廣州市番禺區(qū)。

1.1.2 菌株E.coliDH5α[supE44ΔlacU169 (φ80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1]菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑和儀器 植物RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司；純化mRNA試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit購(gòu)自Clontech公司；[α-32P] dCTP購(gòu)自北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司；隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Gibco公司；LATaqDNA聚合酶、SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶和pMD 18-T 載體購(gòu)自大連寶生物公司。PCR擴(kuò)增儀為2400型PCR儀(Pekin Elmer公司)，凝膠成像系統(tǒng)為Fluor-STMMultilmager(BIO-RAD公司)，激光掃描成像系統(tǒng)為T(mén)yphoon系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)(GE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 取健壯的株高40～50 cm的廣東大蕉幼苗，分兩組，第1組為對(duì)照組，在26～32 ℃下培養(yǎng)，自然光照，相對(duì)濕度60%；第2組為低溫處理組，夜晚在培養(yǎng)箱中10 ℃處理12 h。處理完畢后剪取各組幼苗新展開(kāi)的第2片真葉，用液氮迅速冷凍后，于-70 ℃冰箱中保存。

1.2.2 總RNA的提取和mRNA的純化 采用Invitrogen的ConcertTMPlant RNA Reagent按說(shuō)明書(shū)的方法提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性,用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA的濃度及純度；用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Mini Kits從總RNA中分離mRNA，用3 mol/L NaAc和無(wú)水乙醇濃縮純化的mRNA。

1.2.3 抑制差減雜交 參照CLONTECH PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit使用手冊(cè)，設(shè)定以經(jīng)低溫處理大蕉的mRNA為模板合成的cDNA作為檢測(cè)子，以未經(jīng)處理大蕉的mRNA為模板合成的cDNA作為驅(qū)趕子，進(jìn)行正向差減雜交；反之為反向差減雜交；差減雜交的對(duì)照實(shí)驗(yàn)并列進(jìn)行。

1.2.4 差減文庫(kù)的構(gòu)建 將第二次PCR 擴(kuò)增得到的cDNA 產(chǎn)物用DNA快速純化試劑盒純化后，取8 μL(20 μL的體系)連接到TaKaRa的pMD 18-T 載體上，16 ℃過(guò)夜。第2天，取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)受體菌,涂板后37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜?；谒{(lán)白斑篩選法,從LB平板挑取白色陽(yáng)性克隆菌落接種到300 μL含Amp(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，建立抑制差減cDNA文庫(kù)。采用菌液PCR對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 差異篩選差減文庫(kù) 取構(gòu)建抑制差減cDNA文庫(kù)的重組子1 μL菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增(25 μL的體系)，w=2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分別取2 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)2套重復(fù)的cDNA拷貝膜,并分別以正向和反向差減產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照，以水作為陰性對(duì)照。依據(jù)Invitrogen公司RadPrimer DNA Labeling System Kit 的說(shuō)明利用 [α-32P] dCTP進(jìn)行標(biāo)記，共標(biāo)記2個(gè)探針：正向差減產(chǎn)物探針；反向差減產(chǎn)物探針。

將制備好的膜與探針進(jìn)行雜交[6]，然后置于磷屏內(nèi)壓膜1 h再用激光掃描成像系統(tǒng)成像。

1.2.6 DNA測(cè)序和BLAST分析 選取僅與正向差減探針有信號(hào)及與正向差減探針雜交信號(hào)明顯強(qiáng)于反向差減探針的克隆(信號(hào)強(qiáng)度在2～3倍以上)，送上海博亞公司用T7或M13r引物單向測(cè)序。所獲序列去除載體和接頭序列，獲得EST。采用NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) 的BLASTn 在線序列比對(duì)工具進(jìn)行同源性檢索分析和功能注釋分析。

1.2.7MpRci基因的表達(dá)分析 參照測(cè)序得到的MpRci的EST序列設(shè)計(jì)引物：RCI-124S，5′-ATC CTC CCT CCG CTG GGC GTC TT-3′；RCI-333A，5′-CAG AGC AGG TAG GAA TCG TCC ATA G-3′。以蕉類Actin基因作為內(nèi)參：ACT-S，5′-TGT AGG TGA TGA GGC CCA AT -3′；ACT-A，5′-ATA CCT GTG GTA CGT CCG CT-3′。先按前面所述方法分別提取各樣品的總RNA，然后使用SuperScript II 反轉(zhuǎn)錄酶按說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA用于進(jìn)行基因表達(dá)的PCR分析。進(jìn)一步用Band Leader軟件進(jìn)行灰度分析，然后通過(guò)比較不同樣品目的基因的灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值來(lái)分析基因表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的檢測(cè)及二次PCR產(chǎn)物分析

總RNA和mRNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)顯示完整性良好,完全符合進(jìn)行下游工程的要求。運(yùn)用SSH技術(shù)，進(jìn)行正向和反向差減雜交，差減得到的cDNA群體，經(jīng)過(guò)2次PCR選擇性擴(kuò)增后，進(jìn)行凝膠電泳分析(圖1)，結(jié)果表明，主要的PCR差減產(chǎn)物的核苷酸長(zhǎng)度在0.2～2 kb之間，且有數(shù)條條帶，表明差減雜交后一些共有cDNA片段已被扣除掉。差減雜交的對(duì)照結(jié)果也說(shuō)明差減效率較高。

2.2 差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選

應(yīng)用T/A克隆法，將正向差減PCR產(chǎn)物連入T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建了大蕉冷誘導(dǎo)差減cDNA文庫(kù)。隨機(jī)挑選構(gòu)建差減文庫(kù)的重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，擴(kuò)增條帶即為插入的cDNA片段。每泳道只有1條擴(kuò)增條帶，且集中于0.2～0.5 kb,說(shuō)明酶切、連接、轉(zhuǎn)化效果較好。

圖1 差減雜交后兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

M: DNA markers DL2000; 1: 正向雜交后第一次PCR產(chǎn)物； 2: 反向雜交后第一次PCR產(chǎn)物； 3: 正向雜交后第二次PCR產(chǎn)物； 4: 反向雜交后第二次PCR產(chǎn)物； 5: 對(duì)照，為試劑盒提供的材料經(jīng)差減雜交后二次PCR的產(chǎn)物

圖2 SSH文庫(kù)部分cDNA克隆外源插入片段的PCR檢測(cè)

M: DNA markers DL2 000(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)

采用隨機(jī)引物法標(biāo)記正向差減探針和反向差減探針，再分別與cDNA拷貝膜雜交。對(duì)比與不同探針雜交的兩張重復(fù)拷貝膜的雜交信號(hào)(圖3)，發(fā)現(xiàn)有些克隆與正向差減的探針雜交信號(hào)強(qiáng)但與反向差減探針的雜交信號(hào)弱，這些克隆可能是冷誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的基因；還有一些克隆與正向、反向的差減探針雜交強(qiáng)度沒(méi)有明顯區(qū)別，這些克隆是非差異表達(dá)的基因。用斑點(diǎn)雜交的方法，對(duì)大蕉冷誘導(dǎo)差減文庫(kù)中的約300個(gè)克隆進(jìn)行篩選，挑選約50個(gè)可能為冷誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的克隆進(jìn)行測(cè)序。

圖3 差減文庫(kù)的差異篩選

A: 與正向差減cDNA探針雜交； B: 與反向差減cDNA探針雜交。其中PC1為正向差減產(chǎn)物與正向差減cDNA探針雜交的陽(yáng)性對(duì)照，PC2為反向差減產(chǎn)物與反向差減cDNA探針雜交的陽(yáng)性對(duì)照，NC以水作為陰性對(duì)照。

2.3 序列分析

將DNA測(cè)序得到的序列去除載體、建庫(kù)時(shí)加上的連接序列和3′端的poly(A)，應(yīng)用BLAST軟件在GenBank中進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)同源性的比較和功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多克隆與其它物種已知基因部分區(qū)域有較高的一致性，還有一些克隆與GenBank中查到對(duì)應(yīng)的同源序列同源區(qū)很短或一致性較低，可能是新基因或者由于序列位于變異豐富的3′末端而無(wú)法查到與其它物種基因的同源性。部分序列同源性分析結(jié)果見(jiàn)表1。同源性比較預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，大多數(shù)序列與冷誘導(dǎo)有關(guān)，涉及到細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因、蛋白質(zhì)合成基因、表達(dá)調(diào)控基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因等多種基因。

表1 部分陽(yáng)性克隆的序列比較結(jié)果

2.4 MpRci的表達(dá)分析

為驗(yàn)證克隆到的基因在大蕉中是否為低溫誘導(dǎo)差異表達(dá)，以MpRci的EST序列(克隆序號(hào)為S3)為已知序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果(圖4)顯示大蕉葉片低溫處理后比處理前MpRci的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，確實(shí)為低溫誘導(dǎo)差異表達(dá)。另外，預(yù)測(cè)克隆序號(hào)為S12的基因?qū)儆贏sr基因家族。在我們的相關(guān)研究中，克隆了大蕉MpAsr基因及其上游序列，并將含MpAsr基因上游序列和β-葡萄糖苷酶報(bào)告基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，其組織化學(xué)染色結(jié)果顯示MpAsr基因可受低溫誘導(dǎo)表達(dá)[7]。這些都進(jìn)一步證實(shí)了SSH和反式Northern雜交的結(jié)果。

圖4 MpRci的低溫誘導(dǎo)表達(dá)

A: 采用RT-PCR方法檢測(cè)MpRci在低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)情況；

B：MpRci的灰度值與Actin的灰度值的比值分析；其中1-4分別來(lái)自10 ℃處理0、2、6、12 h的大蕉葉片

3 討 論

目前，分離差異表達(dá)基因的方法有多種，主要有mRNA差異顯示PCR(mRNA DDRT-PCR)、抑制性差減雜交(SSH)、基因表達(dá)連續(xù)性分析(SAGE)和DNA微陣列(DNA microarray)等。在這些方法中，SSH法具有假陽(yáng)性率低、檢測(cè)效率較高和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)[8]。

為比較低溫與非低溫條件下大蕉基因表達(dá)的改變狀況，本研究用抑制性差減雜交的方法構(gòu)建了大蕉冷誘導(dǎo)差減文庫(kù)，并通過(guò)斑點(diǎn)雜交對(duì)文庫(kù)中約300個(gè)克隆進(jìn)行篩選，最終挑選出可能含冷誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)基因片段的約50個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，得到一批與冷誘導(dǎo)相關(guān)的ESTs。經(jīng)同源性比較預(yù)測(cè)，這些ESTs主要涉及以下幾方面：①與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控相關(guān)。如ChaC基因涉及Ca2+離子的跨膜運(yùn)輸及其調(diào)控,還有絲氨酸/蘇氨酸激酶也參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而高速泳動(dòng)族蛋白通常作為影響轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)結(jié)合的輔助因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用[9]。Asr蛋白是一類受ABA、環(huán)境脅迫和成熟誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，涉及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)以抵御逆境[7]。我們對(duì)過(guò)表達(dá)大蕉MpAsr的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果顯示該基因能一定程度上增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的逆境耐受能力[7]。②非生物脅迫與防御相關(guān)，如脫水素基因、細(xì)胞壁富含脯氨酸的蛋白基因Prp和疏水蛋白基因Rci等。脫水素在植物胚胎發(fā)育后期以及逆境下大量表達(dá)，在植物體內(nèi)具有多種保護(hù)作用[10]。而Prp的大量表達(dá)可能加固細(xì)胞壁[11]。低溫誘導(dǎo)基因Rci與PMP3、Lti6是一類同源基因，受多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在逆境下有利于維持質(zhì)膜的穩(wěn)定性，可增強(qiáng)植物的抗寒和耐鹽性[12]，更有研究直接證明大蕉低溫誘導(dǎo)基因MpRci受低溫誘導(dǎo)，且過(guò)表達(dá)MpRci的轉(zhuǎn)基因煙草抵御低溫的能力有所提高[13]。③與蛋白質(zhì)加工和能量代謝相關(guān)，如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和GDP甘露糖苷焦磷酸化酶基因。糖基轉(zhuǎn)移酶是蛋白質(zhì)糖基化過(guò)程的關(guān)鍵酶[14]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶[15]。GDP甘露糖苷焦磷酸化酶則涉及半乳甘露聚糖代謝途徑[16]。④功能未確定基因，但有些基因雖不知確切功能，卻也受低溫或其它脅迫誘導(dǎo)。由此可見(jiàn)，篩選到的ESTs片段涉及到低溫響應(yīng)的各個(gè)方面，提示了大蕉抗寒性的獲得受一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控、非生物脅迫防御、蛋白質(zhì)加工和能量代謝等的變化，特別是低溫下誘導(dǎo)許多具調(diào)控或保護(hù)性功能的基因表達(dá)。進(jìn)一步，其中的MpRci和MpAsr基因經(jīng)過(guò)驗(yàn)證表明可受低溫誘導(dǎo)[7，13]，且轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明MpRci的過(guò)表達(dá)有助于提高植物抵抗低溫的能力[13]，直接證實(shí)了構(gòu)建的大蕉冷誘導(dǎo)差減文庫(kù)確實(shí)包含有抗寒相關(guān)基因，也說(shuō)明采用SSH結(jié)合點(diǎn)雜交差異篩選大蕉抗寒相關(guān)基因是有效的。而且，大蕉作為新的基因資源，得到的大蕉低溫誘導(dǎo)ESTs豐富了大蕉基因信息，也為克隆大蕉抗寒相關(guān)基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以提高植物的抗寒性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] THOMASHOW M F. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol , 1999, 50: 571-599.

[2] GUY C L. Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1990, 41: 187-223.

[3] GUY C, KAPLAN F, KOPKA J, et al. Metabolomics of temperature stress[J]. Physiol Plant, 2008, 132(2): 220-235.

[4] 呂慶芳，豐鋒，張秀枝. 香蕉葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性與耐寒性的關(guān)系[J]. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2000, 20: 48-51.

[5] 陳杰忠，徐春香，梁立峰. 低溫對(duì)香蕉葉片中蛋白質(zhì)及脯氨酸的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999, 20(3): 54-58.

[6] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[7] LIU H Y, DAI J R, FENG D R, et al. Characterization of a novel plantainASRgene,MpASR, that is regulated in response to infection ofFusariumoxysporumf. sp.cubenseand abiotic stresses[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2010, 52: 315-323.

[8] 顧克余，翟虎渠. 抑制性扣除雜交技術(shù)(SSH)及其在基因克隆上的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，1999, 2: 13-16.

[9] CLEYNEN I, VAN DE VEN W J. The HMGA proteins: a myriad of functions[J]. Int J Oncol, 2008, 32(2): 289-305.

[10] 孫歆，雷韜，袁澍，等. 脫水素研究進(jìn)展[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2005, 23(3): 299-304.

[11] SHOWALTER A. Structure and function of plant cell wall proteins[J]. Plant Cell, 1993, 5: 9-23.

[12] KIM S H, KIM J Y, KIM S J, et al. Isolation of cold stress-responsive genes in the reproductive organs, and characterization of theOsLti6bgene from rice (OryzasativaL.) [J]. Plant Cell Rep, 2007, 26: 1097-1110.

[13] FENG D R, LIU B, LI W Y, et al. Over-expression of a cold-induced plasma membrane protein gene (MpRCI) from plantain enhances low temperature-resistance in transgenic tobacco[J]. Environmental and Experimental Botany, 2009, 65: 395-402.

[14] KEEGSTRA K, RAIKHEL N. Plant glycosyltransferases[J]. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4(3): 219-224.

[15] 侯夫云，黃驥，陸駒飛，等. 水稻質(zhì)體葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的克隆與表達(dá)研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 2006, 5: 66-71.

[16] 魏小春，鄭群，劉俊杰. 豆科植物半乳甘露聚糖生物合成及調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶植物科學(xué), 2008, 37(1): 76-81.