中藥丹參[1]的化學(xué)成分主要分為兩類:脂溶性二萜醌類和水溶性酚酸類[2]。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是丹參主要的水溶性成分，具有明顯的抗氧化[3]、放松血管[4]、保肝護肝[5]的作用，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 丹酚酸B的結(jié)構(gòu)式

高速逆流色譜法是由Ito[6]于20世紀80年代研發(fā)的一種新型液液分配技術(shù)。該技術(shù)無需固體載體，消除了樣品的不可逆吸附，且具有分離度高、重現(xiàn)性好、分離量大等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于天然植物的分離[7]。作者針對丹酚酸B極性大的特點，運用高速逆流色譜法對其進行了分離純化。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

丹參購于武漢百姓大藥房，經(jīng)中科院武漢植物園李建強鑒定為丹參根莖。

所用試劑均為分析純，天津富宇精細化工有限公司；雙蒸水，自制。

FastChromeTM分析型高速逆流色譜儀、CXTH-3000色譜工作站、CF-30恒流泵，江陰逆流科技有限公司； 分離柱管直徑1.70 mm，柱體積26.0 mL，進樣環(huán)1.0 mL；UV-3000型紫外檢測器，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；日立液相色譜儀(Hitachi Pump L-2130，Hitachi Autosampler L-2200，Hitachi Column Oven L-2300，Hitachi Diode Array Detector L-2455)；D-2000 Elite 工作站。

HPLC色譜條件：色譜柱：Fortis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：A為甲醇∶乙酸乙酯=4∶1(體積比)，B為0.2%甲酸水溶液，A∶B=40∶60(體積比)；流速1 mL·min-1，溫度28℃，檢測波長280 nm，進樣量50 μL。

1.2 丹酚酸B部位的制備

取丹參切片100 g，粉碎，過200目篩，用70%乙醇溶液超聲提取至無色。合并回收液，于60℃真空回收，制得粗浸膏。將粗浸膏過大孔樹脂柱，流動相為甲醇-0.2%甲酸水溶液，共收集7段，其中第2段為丹酚酸B部位，用于后續(xù)實驗。

1.3 高速逆流溶劑系統(tǒng)選擇

按一定的比例配制溶劑系統(tǒng)，充分振蕩，測定穩(wěn)定時間，取相同體積的上下相溶液，加入一定量的樣品，充分振蕩混合，系統(tǒng)穩(wěn)定后，分別取上下層溶液用HPLC進行含量分析，測定K值。

1.4 純化工藝條件的確定

影響高速逆流系統(tǒng)分離效果的主要參數(shù)為流動相的流速、儀器的轉(zhuǎn)速以及分離的溫度。以保留率和穩(wěn)定時間為考核指標，通過單因素實驗確定最佳參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑系統(tǒng)的確定

溶劑系統(tǒng)的正確選擇是實驗成功的關(guān)鍵因素，合適的兩相系統(tǒng)應(yīng)該遵循以下原則[8]：

(1)具有一定的固定相保留率，一般溶劑的保留率應(yīng)大于30%；

(2)兩相在劇烈振動后，分層穩(wěn)定時間應(yīng)小于30 s；

(3)目標產(chǎn)物的K值應(yīng)該在0.5與2之間；

(4)為了節(jié)約溶劑，要求上下兩相有相近的體積。

根據(jù)各種溶劑的粘度、密度、極性等因素，測定了一系列溶劑系統(tǒng)的上下相體積比、穩(wěn)定時間及K值，結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑系統(tǒng)比較

由表1可知，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(1.0∶6.0∶1.5∶8.0∶0.1)的K值較適合丹酚酸B的分離，因此選擇此溶劑系統(tǒng)為分離的最佳系統(tǒng)。

2.2 純化工藝條件的優(yōu)化(表2)

表2 工藝條件對保留率和穩(wěn)定時間的影響

從表2可知，在轉(zhuǎn)速與溫度(儀器轉(zhuǎn)速為1800 r·min-1、溫度為30℃)一定的條件下，流動相流速越大，保留率越低，穩(wěn)定時間越短。在流動相流速與溫度(流動相流速為0.5 mL·min-1，溫度為30℃)一定的情況下，轉(zhuǎn)速越低，保留率越小，穩(wěn)定時間越長。在轉(zhuǎn)速與流動相流速(儀器轉(zhuǎn)速為1800 r·min-1、流動相流速為0.5 mL·min-1)一定的情況下，溫度越高，保留率越高，但對穩(wěn)定時間幾乎沒有影響。

綜合考慮保留率以及穩(wěn)定時間，確定最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)速1800 r·min-1，流動相流速1.0 mL·min-1，溫度30℃。

2.3 丹酚酸B的分離純化及HPLC分析

將丹酚酸B部位進行HPLC分析，色譜圖見圖2a。由圖2a可知第24 min峰為丹酚酸B，且為最大峰，表明此部位中含多種丹酚酸及鞣質(zhì)，丹酚酸B含量最高。

運用高速逆流色譜對丹酚酸B部位進行分離，分離色譜見圖3，第48 min峰為丹酚酸B，收集丹酚酸B，冷凍干燥。用HPLC分析，其色譜圖見圖2b。由圖2b可知，第24 min峰為丹酚酸B，根據(jù)面積歸一法計算丹酚酸B的純度為98.3%。

圖2 丹酚酸B部位(a)和純化后丹酚酸B(b)HPLC分析

圖3 丹酚酸B高速逆流分離色譜圖

3 結(jié)論

運用高速逆流色譜法分離了丹參的活性成分丹酚酸B，其純度達到98.3%，表明運用高速逆流色譜法能有效純化丹酚酸B，且該方法與傳統(tǒng)柱層析方法相比，具有不可逆吸附、無樣品損失、成本低、方便、快捷等優(yōu)點，可用于丹酚酸B的制備。

參考文獻：

[1] 王舉濤，彭代銀，劉金旗，等.不同產(chǎn)地丹參中丹參酮ⅡA的含量比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2008,14(3)：4-5.

[2] 余世春,琚小龍，段廣勛.丹參的化學(xué)成分和藥理活性研究概況(綜述)[J].安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2002，(2)：43-47.

[3] Liu C S,Chen N H,Zheng J T.Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced cytotoxicity by salvianolic acid B,a new compound isolated from RadixSalviaemiltiorrhizae[J].Phytomedicine,2007,14(7-8):492-497.

[4] Lam Francis F Y,Yeung John H K,Kwan Yiu W,et al.Salvianolic acid B,an aqueous component of danshen (Salviamiltiorrhiza),relaxes rat coronary artery by inhibition of calcium channels[J].European Journal of Pharmacology,2006,553(1-3):240-245.

[5] Lin Y L,Wu C H,Luo M H,et al.Invitroprotective effects of salvianolic acid B on primary hepatocytes and hepatic stellate cells[J].Journal of Ethnopharmacology,2006,105(1-2):215-222.

[6] Ito Y.Countercurrent Chromatography Theory & Practice[M].NewYork:Marcel Dekker Inc,1988:252-360.

[7] 戴德舜,王義明，羅國安.高速逆流色譜研究進展[J].分析化學(xué)，2001，29(5):586-591.

[8] Marston A,Hostettmann K.Developments in the appliacation of counter-current chromatography to plant analysis[J].J Chromatogr A，2006,1112(1-2):181-194.