裂褶菌多糖是從裂褶菌子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中提取出來(lái)的一種中性胞外多糖，是裂褶菌的主要功能成分，具有抑制腫瘤、抗輻射、提高機(jī)體免疫力等多種生理活性[1]。裂褶菌作為一種藥食用真菌，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，研究裂褶菌多糖的固態(tài)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，對(duì)于探討其發(fā)酵機(jī)理、優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)、提高工業(yè)化生產(chǎn)效率具有重要意義。作者在此對(duì)裂褶菌多糖的固態(tài)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以期得到各參數(shù)之間的關(guān)系模型，為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)裂褶菌多糖實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)50875 菌株，自行篩選保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)[2]。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，黃豆粉5，酵母浸膏粉2，KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,VB10.001。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：80%麥麩+20%玉米芯(初始含水量為50%)。

1.3 培養(yǎng)方法

首先將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，于27℃培養(yǎng)6 d；再接種到液體種子培養(yǎng)基，于27℃、180 r·min-1下培養(yǎng)60 h；最后接種到固體培養(yǎng)基，于27℃培養(yǎng)8 d。

1.4 分析與檢測(cè)

為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，固體培養(yǎng)基統(tǒng)一制備、統(tǒng)一接種、混合均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中在同一培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取樣時(shí)同時(shí)取3個(gè)培養(yǎng)瓶分別測(cè)定裂褶菌多糖含量、底物消耗量及菌體含量，取平均值。

1.4.1 裂褶菌多糖含量的測(cè)定

收集固態(tài)發(fā)酵物，60℃烘干6 h,粉碎；80℃水提，4200 r·min-1離心20 min，取上清液，加3 BV乙醇沉淀過(guò)夜；離心、收集醇沉物，定量分散；取分散液適當(dāng)稀釋，采用苯酚-硫酸法[3]測(cè)定總多糖含量。

1.4.2 底物消耗量的測(cè)定[4]

取不同發(fā)酵時(shí)間的培養(yǎng)瓶，將其中的固態(tài)發(fā)酵物于60℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱重，按下式計(jì)算底物消耗量。

1.4.3 菌體量的測(cè)定

菌體量的測(cè)定采用核酸法[5]。

1.5 計(jì)算工具軟件

采用 Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂褶菌多糖固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化

對(duì)裂褶菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔1 d取樣測(cè)定菌體生物量、多糖產(chǎn)量和底物消耗量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 裂褶菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程代謝變化

由圖1可以看出，裂褶菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)曲線呈“S”型，多糖產(chǎn)量同菌體的生長(zhǎng)同步。表明該發(fā)酵過(guò)程屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型[6]。

2.2 固態(tài)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

借鑒藥用真菌液體深層發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)模型，基于以下假設(shè)：(1)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)溫度和濕度等參數(shù)衡定，生物量、基質(zhì)成分以及裂褶菌多糖的含量等亦均勻一致，即固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器是一個(gè)理想的全混反應(yīng)器；(2)菌體生長(zhǎng)為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長(zhǎng)，細(xì)胞成分僅需用一個(gè)參數(shù)即菌體濃度表示即可；(3)培養(yǎng)基中只有一種底物是細(xì)胞生長(zhǎng)限制性底物，其它營(yíng)養(yǎng)成分及氧氣供應(yīng)不影響微生物的生長(zhǎng)；(4)將微生物生長(zhǎng)視為簡(jiǎn)單反應(yīng)[7，8]。

2.2.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

菌體生長(zhǎng)曲線呈“S”型，可以用Logistic模型[6,9]來(lái)描述，即：

(1)

式中：X為細(xì)胞濃度,g·(100 g)-1；Xmax為最大細(xì)胞濃度,g·(100 g)-1；μmax為最大比生長(zhǎng)速率,d-1。

2.2.2 多糖合成動(dòng)力學(xué)模型

已知裂褶菌多糖合成屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，根據(jù)微生物產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)Luedeking-Pirct模型[8,9]，得

(2)

式中：P為產(chǎn)物濃度，g·(100 g)-1；α為與菌體生長(zhǎng)量關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù),g·(100 g)-1·d-1。

2.2.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

常用的底物消耗動(dòng)力學(xué)模型是基于底物消耗物料恒算建立的方程式[8]：

(3)

式中：YX/S=ΔX/ΔS，細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的得率系數(shù)，g·(100 g)-1；YP/S=ΔP/ΔS為產(chǎn)物對(duì)基質(zhì)的得率系數(shù)，g·(100 g)-1；S為底物量，%；Ke為細(xì)胞維持系數(shù)，單位質(zhì)量干細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)維持代謝消耗的基質(zhì)量，g·(100 g)-1·d-1。

在固態(tài)發(fā)酵生成裂褶菌多糖的過(guò)程中，維持菌體代謝所消耗的底物量很有限，因此認(rèn)為底物消耗主要用于菌體生長(zhǎng)和多糖的合成，所以(3)式可以簡(jiǎn)化為：

(4)

2.3 動(dòng)力學(xué)模型的求解擬合

2.3.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型求解

在式(1)中，t=0時(shí)，X=X0，積分得到：

Xt=X0exp(μmaxt)/{1-(X0/Xmax)[1-exp(μmaxt)]}

(5)

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直接讀出X0=2.07 g·(100 g)-1、Xmax=6.82 g·(100 g)-1，以ln[Xt/(Xmax-Xt)]對(duì)時(shí)間t作圖，其斜率即為μmax，得到μmax=0.7385 d-1。得到裂褶菌多糖固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型為：

Xt=2.07exp(0.7385t)/{1-0.3035[1-exp(0.7385t)]}

(6)

用Origin 8.0軟件對(duì)裂褶菌菌絲體生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖2，其中R=0.99256，表明所選模型準(zhǔn)確地反映了菌體生長(zhǎng)的實(shí)際情況。

圖2 裂褶菌菌體生長(zhǎng)擬合曲線

2.3.2 多糖合成動(dòng)力學(xué)模型求解

將式(1)代入式(2)中，積分得：

Pt=P0+α(Xt-X0)

(7)

以Pt對(duì)(Xt-X0)作圖,可得斜率α=1.9493，而P0=0 g·(100 g)-1,已知X0=2.07 g·(100 g)-1，那么多糖合成的動(dòng)力學(xué)模型為：

Pt=1.9493(Xt-2.07)

(8)

對(duì)裂褶菌多糖產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,結(jié)果見(jiàn)圖3，其中R=0.99163，表明所選模型很好地反映了多糖合成的實(shí)際情況。

圖3 裂褶菌多糖合成擬合曲線

2.3.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型求解

將式(1)代入式(4)中，積分得：

St=S0-b2(Xt-X0)

(9)

式中：b2=1/YX/S。

以St對(duì)(Xt-X0)作圖，得：S0= 0.3766，b2=-0.6458，已知X0=2.07 g·(100 g)-1，得底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型為：

St=0.3766+0.6458(Xt-2.07)

(10)

對(duì)底物消耗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,結(jié)果見(jiàn)圖4，其中R=0.98835，表明所選模型較好地反映了底物消耗的實(shí)際情況。

圖4 底物消耗擬合曲線

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)裂褶菌多糖發(fā)酵過(guò)程的研究，發(fā)現(xiàn)裂褶菌菌體生長(zhǎng)和多糖的合成屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，即隨著菌體生長(zhǎng)，底物被迅速利用，并在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中合成多糖?；贚ogistic方程和Luedeking-Pirct方程，結(jié)合數(shù)學(xué)推導(dǎo)并應(yīng)用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算，得到了菌體生長(zhǎng)、多糖合成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型及其參數(shù)，結(jié)果表明該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好地?cái)M合。

參考文獻(xiàn)：

[1] Udo R.Production of schizophyllan[J]．Carbohydrate Biotechnology Protocols，1999,10(6)：43-45．

[2] 常景玲，李慧，潘靜．裂褶菌胞外多糖發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]．食用菌，2006,28(增)：78-80．

[3] 張龍翔，強(qiáng)廷芳，李令援．生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1981：6-9．

[4] 熊曉輝，張李陽(yáng)，韋策，等.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的動(dòng)力學(xué)模型[J]．工業(yè)微生物，2003，33(4)：27-31．

[5] 魏培蓮，岑沛霖，盛春琦．3種固態(tài)發(fā)酵生物量測(cè)定方法的比較[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25(1)：60-64，69．

[6] 倫世儀.生化工程(第二版)[M]．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998：113-114．

[7] 魏培蓮，徐志南，彭勇,等.土曲霉固態(tài)發(fā)酵lovastatin的動(dòng)力學(xué)研究[J]．高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2008，22(6)：1010-1014．

[8] 王二強(qiáng)，耿欣，李十中,等.甜高粱稈分批固態(tài)發(fā)酵制乙醇動(dòng)力學(xué)研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2009,(10)：1-4．

[9] Wdss R M,Ollis D F．Extracellular microbial polysaccharides．I．Substrate，biomass，and product kinetic equations for batch xanthan gum fermentation[J]．Biotechnology and Bioengineering,1980,22(3)：859-873．