紫杉醇是紅豆杉屬(Taxusspp.)植物的次生代謝產(chǎn)物之一，可通過促進(jìn)微管聚合、抑制微管蛋白解聚來抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗癌活性，尤其對卵巢癌、乳腺癌等有良好的療效，臨床應(yīng)用廣泛。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供了一種可行的獲得紫杉醇的途徑，但由于植物細(xì)胞生長速度緩慢和產(chǎn)生的有效成分含量低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此有必要探索提高懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇含量的新方法。

電刺激效應(yīng)對植物愈傷組織的研究始于20世紀(jì)80年代[1]。 Rathore等[2]和Goldsworthy等[3]對煙草愈傷組織進(jìn)行1×10-6A的電流刺激，使生長速率提高70%。王小佳等[4]研究發(fā)現(xiàn)0.67×10-6～2.60×10-6A微電流刺激能促進(jìn)甘藍(lán) (Brassicaoleraceavar.capitata)愈傷組織分化為芽。250～2000 V的電場脈沖能提高灰大豆、歐洲甜櫻桃[5]、小麥[6]、石防風(fēng)[7]等作物原生質(zhì)體生活力和植板率。但電刺激對植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響還未見報道。

作者研究了脈沖電刺激及微交流電刺激對處于不同生長時期的紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響，初步探討了電流對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長及次生代謝的影響，以探索提高紫杉醇產(chǎn)量的新方法。

1 實(shí)驗

1.1 材料、培養(yǎng)基及儀器

1.1.1 紅豆杉細(xì)胞株

來源于中國紅豆杉(Taxuschinensis)的疏松愈傷組織傳代細(xì)胞系，編號C42,自行提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

紅豆杉細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)基為自行優(yōu)化的MS培養(yǎng)基，簡稱M62培養(yǎng)基[8]，其中含NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1、2,4-D 0.08 mg·L-1。

1.1.3 儀器

電極材料為直徑1 mm的不銹鋼絲，電極長5.7 cm、寬0.6 cm，兩電極相距2 cm。電極固定在兩片薄塑料片(可耐高溫、高壓，在培養(yǎng)基中不發(fā)生任何變化)上，一端引出兩條耐高溫滅菌的絕緣導(dǎo)線與儀器的正負(fù)極連接，置于250 mL三角瓶中滅菌待用。

Gilson型高效液相色譜系統(tǒng)，Waters型高效液相色譜系統(tǒng)。

脈沖電刺激儀器：G6805型治療儀，上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司；微交流電刺激儀器：FJ-XD11PS型多用信號發(fā)生器，埠陽市應(yīng)用技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

將M62液體培養(yǎng)基分裝到置有電極的250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121℃ 高壓滅菌25 min。細(xì)胞鮮重接種量為10%(質(zhì)量體積比)，于25℃、光照10 h·d-1、120 r·min-1培養(yǎng)。

1.2.2 脈沖電刺激處理紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1.2.2.1 脈沖電刺激參數(shù)

脈沖波頻率為100 Hz，即每秒100次；周期10 ms；總峰寬1.56 ms;電場強(qiáng)度25 V·cm-1、75 V·cm-1、125 V·cm-1、175 V·cm-1；刺激時間1 h、3 h、5 h、7 h。

1.2.2.2 不同強(qiáng)度脈沖電刺激處理

紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長至第7 d、20 d時，將細(xì)胞分為五組，一組為對照組，不進(jìn)行任何處理；另外四組分別進(jìn)行不同強(qiáng)度的脈沖電刺激，刺激時間均為3 h，刺激強(qiáng)度分別為25 V·cm-1、75 V·cm-1、125 V·cm-1、175 V·cm-1。研究不同刺激強(qiáng)度下，進(jìn)行3 h脈沖電刺激處理對紅豆杉細(xì)胞的影響。

1.2.2.3 不同時間脈沖電刺激處理

紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長至第7 d、20 d時，將細(xì)胞分為五組，一組為對照組，不進(jìn)行任何處理；另外四組分別進(jìn)行不同時間的脈沖電刺激，刺激強(qiáng)度均為175 V·cm-1，刺激時間分別為1 h、3 h、5 h、7 h。研究不同時間脈沖電刺激處理對紅豆杉細(xì)胞的影響。

1.2.3 微交流電刺激處理紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

在紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的第0 d、7 d、14 d、21 d、28 d，對其進(jìn)行微交流電刺激，刺激時間為7 d，刺激電流為50 Hz的正弦交流電(用數(shù)字示波器測得其峰值為16.6 V，計算其平均有效電壓為5.8 V)。通過串加不同的電阻，獲得不同強(qiáng)度的刺激電流，分別為18 μA、36 μA、72 μA、126 μA。

1.2.4 細(xì)胞生物量的測定

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)28 d后，收獲細(xì)胞并減壓抽濾，稱量細(xì)胞質(zhì)量即為細(xì)胞的鮮重(FW)；將細(xì)胞置于冷凍干燥器中干燥后，其質(zhì)量為細(xì)胞的干重(DW)。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)紫杉醇含量的測定

準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后細(xì)胞100 mg，充分研磨，每次加入3 mL甲醇重復(fù)浸提，合并浸提液并減壓抽干，加入氯仿∶水(2∶8)10 mL萃取3次，取氯仿相，減壓除去氯仿，浸膏用1 mL甲醇定容，HPLC測定紫杉醇含量(以每升培養(yǎng)基中紫杉醇的毫克數(shù)表示)。

1.2.6 培養(yǎng)液中紫杉醇含量的測定

取經(jīng)過抽濾后的細(xì)胞培養(yǎng)液20 mL，加入氯仿∶甲醇(1∶1)5 mL，振蕩均勻，靜置后離心，取氯仿相，重復(fù)2次，減壓除去氯仿，殘留物質(zhì)用1 mL甲醇定容，HPLC測定紫杉醇含量(以每升培養(yǎng)基中紫杉醇的毫克數(shù)表示)。

1.2.7 紫杉醇胞外釋放率的計算

2 結(jié)果與討論

2.1 脈沖電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及產(chǎn)紫杉醇的影響

2.1.1 第7 d脈沖電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及產(chǎn)紫杉醇的影響(圖1)

1#.3 h、25 V·cm-1 2#.3 h、75 V·cm-1 3#.3 h、125 V·cm-1 4#.3 h、175 V·cm-1 5#.1 h、175 V·cm-1 6#.3 h、175 V·cm-1 7#.5 h、175 V·cm-1 8#.7 h、175 V·cm-1

由圖1可知，細(xì)胞生長第7 d經(jīng)脈沖電刺激處理后，細(xì)胞生物量和紫杉醇含量比對照都有所增加。其中以3 h、175 V·cm-1(4#和6#處理組)處理促進(jìn)了紫杉醇的產(chǎn)生，含量達(dá)到2.82 mg·L-1，是對照的2倍多。

2.1.2 第7 d脈沖電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇釋放的影響(表1)

表1 第7 d脈沖電刺激后紫杉醇的胞外釋放率

從表1可以看出，175 V·cm-1下脈沖電刺激處理7 h效果明顯，胞外釋放率達(dá)到41%左右，是對照的4.3倍左右。這可能是因為，脈沖電刺激處理使紅豆杉細(xì)胞膜相對透性增大，細(xì)胞滲透率提高，不但利于紫杉醇的釋放，也增強(qiáng)了對液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的利用，經(jīng)適宜劑量的脈沖電處理后，紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)紫杉醇由非分泌型轉(zhuǎn)化為分泌型。

2.1.3 第20 d脈沖電刺激對紅豆杉細(xì)胞生長及產(chǎn)紫杉醇的影響(圖2)

1#.3 h、25 V·cm-1 2#.3 h、75 V·cm-1 3#.3 h、125 V·cm-1 4#.3 h、175 V·cm-1 5#.1 h、175 V·cm-1 6#.3 h、175 V·cm-1 7#.5 h、175 V·cm-1 8#.7 h、175 V·cm-1

由圖2可以看出，各處理組的紫杉醇含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出對照，其中2#、3#、4#、6#處理組細(xì)胞紫杉醇含量提高最大，是對照的7～9倍，最高達(dá)到12.24 mg·L-1。

2.1.4 第20 d脈沖電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇釋放的影響(表2)

表2 第20 d脈沖電刺激后紫杉醇的胞外釋放率

從表2可以看出，細(xì)胞生長到第20 d時進(jìn)行脈沖電刺激，不同處理均明顯提高了紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的紫杉醇胞外釋放率，最高可達(dá)43%左右，是對照的4.4倍左右，與第7 d相應(yīng)處理細(xì)胞的胞外釋放率類似。

2.2 微交流電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)紫杉醇的影響(圖3)

圖3 微交流電刺激后紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的紫杉醇含量

由圖3可以看出，在細(xì)胞生長的不同時期對細(xì)胞進(jìn)行微交流電刺激，當(dāng)電流強(qiáng)度低于18 μA時，紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的含量受電流強(qiáng)度的影響不明顯；當(dāng)電流強(qiáng)度高于18 μA時，紫杉醇的含量明顯增加，并且不同生長時期微交流電的最佳處理強(qiáng)度不同。在細(xì)胞生長的衰亡期(21～28 d)進(jìn)行微交流電刺激可以大幅提高紫杉醇的含量，最高達(dá)5.7 mg·L-1，較未處理細(xì)胞提高3倍多。

2.3 討論

目前對電刺激效應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識還處于假說階段，完整的實(shí)驗證據(jù)較少，由于所選用的實(shí)驗材料和實(shí)驗體系不同，各作者的觀點(diǎn)和側(cè)重點(diǎn)也不盡相同。就原生質(zhì)體而言，電刺激的作用可從兩方面考慮，一方面電刺激可能會改變原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)和成分，Ca2+學(xué)說認(rèn)為[3,9]：Ca2+從細(xì)胞生長旺盛的一極流入，停留在細(xì)胞生長的部位以活化促進(jìn)生長的酶。另一方面電刺激能改變質(zhì)膜的滲透性，增強(qiáng)對培養(yǎng)基中各種成分的吸收，導(dǎo)致內(nèi)源生長激素增加，原生質(zhì)體生長和分裂加快。對器官培養(yǎng)來說[10,11]，電流促進(jìn)芽分化的實(shí)驗說明電控制組織培養(yǎng)中細(xì)胞的極性，外加電流通過恢復(fù)和加強(qiáng)細(xì)胞極性的共調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)組織中的器官發(fā)生。

本實(shí)驗中，在紅豆杉細(xì)胞對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，經(jīng)兩種電刺激處理后的細(xì)胞生物量明顯提高，與對照相比，顏色明亮，細(xì)胞呈細(xì)粉狀，分散性較好，推測是由于細(xì)胞與液體培養(yǎng)基的有效接觸面積增大，有利于細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)及進(jìn)行物質(zhì)能量的交換，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長；紫杉醇胞外釋放率的提高也說明電刺激增加了細(xì)胞質(zhì)膜的通透性。后續(xù)實(shí)驗將對電流處理后細(xì)胞的相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以明確電刺激對紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞作用的機(jī)理。

3 結(jié)論

采用脈沖電刺激和微交流電刺激均可促進(jìn)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)紫杉醇，最佳作用時間是在紅豆杉細(xì)胞生長的衰亡期，微交流電刺激可使紫杉醇含量提高3倍多，而脈沖電刺激處理組則是對照的7～9倍，最高達(dá)到12.24 mg·L-1。說明脈沖電刺激對于促進(jìn)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)紫杉醇更有效。本實(shí)驗所用的細(xì)胞系屬于非分泌型，經(jīng)測定培養(yǎng)基中紫杉醇的含量表明，脈沖電刺激可有效提高紫杉醇的胞外釋放率，是對照的4～5倍。

參考文獻(xiàn)：

[1] Dijak M，Smith D L，Wilson T J，et al．Stimulation of direct embryogenesis from mesophyll protoplasts ofMedicagosativa[J]．Plant Cell Reports，1986，5(6)：468-470.

[2] Rathore K S,Goldsworthy A．Electrical control of growth in plant tissue cultures[J]．Nature Biotechnology，1985，3：253-254.

[3] Goldsworthy A,Rathore K S．The electrical control of growth in plant tissue cultures：The polar transport of auxin[J]．J Exp Bot，1985，36(7)：1134-1141.

[4] 王小佳，王強(qiáng)，宋明，等．甘藍(lán)組織培養(yǎng)中微電流刺激效應(yīng)[J]．植物學(xué)報，1993，35(S1)：56-70.

[5] Rech E L，Ochatt S J，Chand P K，et al．Electro-enhancement of division of plant protoplast-derived cells[J]．Protoplasma，1987，141(2-3)：169-176.

[6] 戴群，夏光敏，郭光沁．微直流對小麥原生質(zhì)體形成細(xì)胞團(tuán)的促進(jìn)作用[J]．植物學(xué)報，1995，37(2)：162-164.

[7] 李忠誼，陳惠民．石防風(fēng)原生質(zhì)體再生植株[J]．植物學(xué)報，1987，29(5)：354-356.

[8] 梅興國，董妍玲，潘學(xué)武.紅豆杉抗苯丙氨酸細(xì)胞系的篩選及懸浮培養(yǎng)特性[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001,13(5)：9-12.

[9] 李大輝，施國新，丁小余，等．Cd2+、Hg2+對菱幼苗生長及其超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性的影響[J]．武漢植物學(xué)研究，1999，17(3)：206-210.

[10] Jaffe L F．Electrophoresis along cell membranes[J]．Nature，1977，265(5595)：600-602.

[11] Li Zhongyi，Tanner G J，Larkin P J．Callus regeneration fromTrifoliumsubterraneumprotoplasts and enhanced protoplast division by low-voltage treatment and nurse cells[J]．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1990，21(1)：67-73.