魏微,張微微,王娟,李蓓蓓

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100700;2.第三軍醫(yī)大學(xué),重慶400038

血-腦脊液屏障(blood brain barrier,BBB)由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突和周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及維持腦組織完整性的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,是神經(jīng)血管單元的核心結(jié)構(gòu)[1,2]。在慢性低灌注狀態(tài)下,BBB滲透性增加。本研究通過(guò)觀察長(zhǎng)期慢性低灌注大鼠BBB通透性的改變及給予丁苯肽干預(yù)后BBB通透性改變,以探討丁苯肽腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動(dòng)物:成年雄性SPF級(jí)Wist-ar大鼠144只,體質(zhì)量250～300 g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供[動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK-(軍)2007-004]。②主要試劑與材料:丁苯肽注射液(購(gòu)于石藥集團(tuán)股份有限公司);伊文思藍(lán)(購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及干預(yù) 雄性Wistar大鼠144只隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、丁苯肽組,各48只,每組大鼠按時(shí)間點(diǎn)分為缺血后7 d、14 d、30 d、60 d 亞組。戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,頸正中切口切開(kāi)皮膚,剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌,暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈,并分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。缺血組與丁苯肽組大鼠結(jié)扎頸總動(dòng)脈,假手術(shù)組不結(jié)扎,縫合皮膚。術(shù)后大鼠均在同條件的層流動(dòng)物室飼養(yǎng)(共死亡大鼠14只,按需補(bǔ)足只數(shù))。丁苯肽組大鼠每天腹腔注射丁苯肽注射液2 mg/kg,缺血組及假手術(shù)組大鼠每天腹腔注射生理鹽水1 mL,共7 d。

1.2.2 腦組織伊文思藍(lán)含量檢測(cè) 缺血后各時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)3 mL/kg后處死大鼠,取腦前用生理鹽水灌注大鼠,以清除血液中染料。取腦后稱重,加入2倍體積的二甲基甲酰胺,50℃水浴中孵育72 h,震蕩混勻后15000 rpm離心20 min,取上清,加入3 mL純乙酸,熒光分光光度計(jì)測(cè)定伊文思藍(lán)分光光度值,激發(fā)波長(zhǎng)620 nm,發(fā)射波長(zhǎng)680 nm。以熒光分光光度值代表大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量。

1.2.3 伊文思藍(lán)染色 腹腔注射麻醉大鼠,打開(kāi)胸腔,經(jīng)左心室穿刺入升主動(dòng)脈快速灌注2%伊文思藍(lán)-PBS 100 mL,隨后灌注生理鹽水至流出液清亮為止。取腦后置于4%多聚甲醛-PBS溶液中固定24 h,萊卡振動(dòng)切片機(jī)切片 ,厚度 200 μ m,封片 ,攝片 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 15.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以±s)表示,單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織伊文思藍(lán)含量檢測(cè)結(jié)果 缺血組7 d亞組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01),高于丁苯肽組(P＜0.05);缺血組14 d亞組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量高于假手術(shù)組及丁苯肽組(P＜0.05)。缺血組30 d及60 d亞組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。

2.2 伊文思藍(lán)染色結(jié)果 根據(jù)Paxinos-Watson大鼠解剖圖譜[3],選擇 Bregma-1.08 mm,Interaural 7.92 mm層面。可見(jiàn)假手術(shù)組BBB完整,僅側(cè)腦室內(nèi)脈絡(luò)叢有少量伊文思藍(lán)滲出,見(jiàn)圖1A;缺血組7 d亞組可見(jiàn)伊文思藍(lán)在側(cè)腦室脈絡(luò)叢、三腦室、雙側(cè)額顳皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)區(qū)、枕葉皮質(zhì)及基底核區(qū)滲出較多,丁苯肽組在上述部位的滲出相對(duì)減少,見(jiàn)圖1B-C;缺血組14 d亞組BBB的破壞較7 d亞組減輕,僅見(jiàn)基底核及枕葉皮質(zhì)局部伊文思藍(lán)滲出,丁苯肽組BBB損害相對(duì)輕;30 d后BBB破壞基本修復(fù),側(cè)腦室脈絡(luò)叢有少量伊文思藍(lán)滲出,丁苯肽組比缺血組修復(fù)更好;各60 d亞組BBB修復(fù)完全,同假手術(shù)組無(wú)差異。

3 討論

BBB是存在于腦組織與血液之間的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng),內(nèi)皮細(xì)胞依靠緊密連接構(gòu)成一個(gè)連續(xù)密封的網(wǎng),是大分子物質(zhì)經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的屏障,其破壞將導(dǎo)致血漿成分外滲和水腫形成。伊文思藍(lán)是一種偶氮基熒光染料,能與血清蛋白結(jié)合,屬于大分子染色劑,正常情況下血管內(nèi)的伊文思藍(lán)不能透過(guò)BBB進(jìn)入腦組織,但在BBB受損時(shí),部分伊文思藍(lán)可以通過(guò)血管內(nèi)皮等結(jié)構(gòu)滲入腦組織,按照Uyama[4]的方法,可以通過(guò)滲出血管外的伊文思藍(lán)的量來(lái)評(píng)價(jià)BBB的通透性,這是目前評(píng)價(jià)BBB通透性的經(jīng)典方法。

慢性低灌注后有BBB的破壞,但較缺血損傷時(shí)輕,可能與基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),BBB在慢性低灌注后 7 d損傷較重,與 Tomimoto等[5-7]及Tsuchiya等[8,9]的研究一致。缺血后期有膠原增生,基底膜修復(fù)。伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示30 d后BBB開(kāi)始修復(fù),60 d后恢復(fù)正常。BBB的修復(fù)的具體機(jī)制不詳,可能與基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子之間的綜合作用有關(guān)[3-7,5-9]。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織伊文思藍(lán)染色熒光分光光度值比較(±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織伊文思藍(lán)染色熒光分光光度值比較(±s)

與丁苯肽組比較,①P＜0.05;與假手術(shù)組比較,②P＜0.05,③P＜0.01

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圖1 A-C 假手術(shù)組(A)、缺血組7 d亞組(B)及丁苯肽組7 d亞組(C)大鼠腦組織伊文思藍(lán)染色結(jié)果

丁苯酞是一種新型抗腦缺血藥物,可通過(guò)解除微血管痙攣、抑制血小板聚集、抑制TXA2的合成等多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷腦缺血引起的病理生理發(fā)展過(guò)程[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)丁苯肽組7 d及14 d亞組BBB的滲透性增高程度均較缺血組減輕。30 d后BBB破壞基本修復(fù),丁苯肽組比缺血組修復(fù)更好。作為BBB的重要部分,內(nèi)皮細(xì)胞在缺血缺氧損害過(guò)程中,線粒體功能受損,影響細(xì)胞能量代謝,緊密連接增寬,細(xì)胞水腫,是血管源性水腫的基礎(chǔ)。研究表明,丁苯酞通過(guò)改善線粒體膜流動(dòng)性,恢復(fù)線粒體膜電位,提高線粒體磷酸腺苷酶及復(fù)合酶IV的活性,增加超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性,從而保護(hù)線粒體[12,13]。其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用可能是其對(duì)BBB保護(hù)作用的基礎(chǔ)。另外,丁苯肽通過(guò)對(duì)細(xì)胞炎性因子的抑制作用可能影響基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,在保護(hù)BBB中也可能發(fā)揮了重要作用。

每一個(gè)神經(jīng)元都有相應(yīng)的毛細(xì)血管,BBB病變,通過(guò)BBB物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降,對(duì)神經(jīng)毒性物質(zhì)的清除能力減弱。BBB是神經(jīng)血管單元的各種組織成分交互作用的基礎(chǔ),任何部分損傷都可以影響其它成員。保護(hù)神經(jīng)血管單元是缺血性損傷更現(xiàn)實(shí)的治療靶點(diǎn)[10]。腦慢性低灌注特點(diǎn)是腦缺血時(shí)間長(zhǎng),沒(méi)有發(fā)生缺血再灌注,腦部始終處于低灌注狀態(tài)。本研究顯示丁苯肽對(duì)慢性低灌注神經(jīng)血管單元有保護(hù)性的作用,期望為臨床上與慢性低灌注相關(guān)的輕度認(rèn)知功能障礙的防治提供新的研究思路。

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