金德莊，張 聰

(1.上海市食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評(píng)中心，上海 200021;2.上海市中藥研究所，上海 200002)

山茱萸具有補(bǔ)益肝腎、收斂固澀的功效，主要含有有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜類、皂苷、多糖等。文獻(xiàn)[1]采用高效液相色譜(HPLC)法，以齊墩果酸或熊果酸為指標(biāo)分析山茱萸的質(zhì)量。對(duì)山茱萸進(jìn)行定量分析，大多是針對(duì)熊果酸，而對(duì)齊墩果酸和熊果酸同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道則極少?！吨袊幍?一部)》采用薄層掃描法對(duì)六味地黃丸中山茱萸的有效成分熊果酸進(jìn)行了定量分析，但操作煩瑣，顯色誤差大，重現(xiàn)性差。本試驗(yàn)采用反相HPLC法，通過優(yōu)化色譜條件來實(shí)現(xiàn)熊果酸與齊墩果酸的同時(shí)測(cè)定，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 510型 HPLC Pump，Waters 996 PDA檢測(cè)器(美國 Waters公司);Millennium 32軟件色譜工作站;SY3200型超聲波(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。甲醇、乙腈(美國Merks公司);齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)為709－8903，中國藥品生物制品檢定所);熊果酸對(duì)照品(批號(hào)為77－52－1，MP Biomedicals Znc);其余試劑均為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司);水為蒸餾水。山茱萸樣品見表1，均經(jīng)上海市藥材公司王依群副主任藥師鑒定;除河南南陽產(chǎn)的藥材(1)是2002年采收，其余皆采收于2003年。

表1 不同產(chǎn)地的山茱萸樣品表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相選擇:山茱萸的主要成分包括非極性成分齊墩果酸與熊果酸，兩者都屬于大分子的有機(jī)酸，結(jié)構(gòu)相似，極性相近，選擇合適的流動(dòng)相分開這兩個(gè)成分的色譜峰，使分離度(Rs＞1.5)達(dá)到一定要求是本次試驗(yàn)的難點(diǎn)之一，故流動(dòng)相的選擇是關(guān)鍵。經(jīng)多次試驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相為乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)。

流動(dòng)相流速選擇:考察了流動(dòng)相不同流速(0.6，0.8，1.0mL/min)對(duì)分離組分的影響。結(jié)果流速對(duì)樣品的分離效果無影響，但可影響組分出峰時(shí)間的快慢。其中流速為0.6 mL/min時(shí)保留時(shí)間過長，流速為1.0 mL/min時(shí)保留時(shí)間較好，但流速大可引起色譜儀的柱壓過高，故選用0.8 mL/min為流動(dòng)相流速。

檢測(cè)波長選擇:精密稱取山茱萸藥材粗粉，用無水乙醇超聲30 min，揮干、水溶出，用氯仿萃取，氯仿液揮干，用甲醇定容至20 mL。按擬訂的色譜條件測(cè)定，波長范圍在200～400 nm[2]。比較

了多波長下的色譜圖，最后選擇210.2 nm為檢測(cè)波長，此時(shí)色譜圖出峰數(shù)多、峰面積大，可提供的信息多，靈敏度高。

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

提取方法選擇:精密稱取樣品1 g，置圓底燒瓶中，加入40 mL無水乙醇，水浴60℃，回流提取2 h，過濾后，濾液置50 mL量瓶中，定容至50 mL，結(jié)果見圖1。精密稱取山茱萸藥材粗粉5 g，加無水乙醇30 mL，超聲提取30 min，提取液揮干，水溶出，用氯仿萃取3次，揮干氯仿，甲醇定容10 mL。結(jié)果見圖2。綜合考察，選擇無水乙醇超聲提取為樣品提取方法。

圖1 乙醇回流提取色譜圖

圖2 乙醇超聲提取色譜圖

提取溶劑選擇:精密稱取樣品粗粉(20目)，分別采用95%乙醇、無水乙醇、加熱回流及超聲提取，用氯仿、乙醚索氏提取。通過對(duì)上述幾種溶劑的提取效果進(jìn)行分析，結(jié)果采用無水乙醇提取的樣品雖然極性成分與非極性成分的比例仍相差較大，但可見提取得到的齊墩果酸和熊果酸成分峰。在此基礎(chǔ)上，對(duì)無水乙醇超聲提取液進(jìn)行氯仿萃取，可去除部分極性成分。結(jié)果經(jīng)過氯仿萃取的樣品中齊墩果酸和熊果酸的相對(duì)含量明顯提高，可以進(jìn)行含量測(cè)定。

萃取次數(shù)考察:精密稱取山茱萸粗粉5 g，加無水乙醇50 mL，超聲提取30 min，提取液揮干，加50 mL水溶解，加50 mL氯仿萃取2，3，4次，揮干氯仿，甲醇定容20 mL，測(cè)定齊墩果酸與熊果酸的含量。結(jié)果表明，采用3次萃取即可使待測(cè)成分完全轉(zhuǎn)移，故確定的萃取方法為加氯仿萃取3次、每次50 mL。

超聲提取條件選擇:從無水乙醇對(duì)山茱萸藥材的提取方法考察來看，采用熱回流和超聲提取效率相同，且超聲提取省時(shí)省力，故采用超聲提取。超聲提取過程的主要影響因素包括溶劑加入量、超聲時(shí)間及超聲提取次數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取最佳條件是10倍量的無水乙醇、提取2次、每次30 min。

2.3 色譜峰定位與純度鑒定

精密稱取華宇產(chǎn)山茱萸藥材粗粉5 g，加無水乙醇50 mL，超聲提取2次，每次30 min，提取液揮干，加水適量溶解，等體積氯仿萃取3次，氯仿液揮干，甲醇定容20 mL，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。在利用色譜法定性時(shí)，關(guān)鍵是需要確認(rèn)所分離出來的色譜峰是純組分，還是包含了其他化合物(不純組分)，這僅從UV檢測(cè)器的色譜儀所提供的色譜圖來作判斷是不夠的。而PDA檢測(cè)器的色譜儀就能判斷色譜峰的純度，它從2個(gè)方面入手，一是分析待測(cè)成分與其標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的紫外光譜圖是否一致。二是純度角與純度閥值的比較。取2.2項(xiàng)萃取次數(shù)考察試驗(yàn)中樣品，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰純度角及純度閾值。結(jié)果見表2?？梢?，待測(cè)峰純度符合要求，可以進(jìn)行含量測(cè)定。

表2 待測(cè)成分峰純度鑒定

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱:YMC －PACK ODS－A 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 －0.1%磷酸 －甲醇(40 ∶10 ∶30);檢測(cè)波長:210.2 nm;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:25 ℃。

2.4.2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:分別精密稱取齊墩果酸對(duì)照品15.2 mg或熊果酸對(duì)照品32.8 mg，以甲醇定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度分別為1.52 mg/mL 和 3.28 mg/mL 的對(duì)照品溶液，分別精密吸取 0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 mL，定容至 10 mL，進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸。得回歸方程齊墩果酸 Y=－9 318.585+5 942 790 X(r=0.999 9)，熊果酸 Y= －28 338.061+4 698 400 X(r=0.999 5)。結(jié)果表明，齊墩果酸與熊果酸進(jìn)樣量分別在0.38 ～3.04 μg和0.82 ～6.56 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):分別精密吸取齊墩果酸與熊果酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸峰面積的 RSD分別為1.21%和 2.22%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，每間隔30 min進(jìn)樣。結(jié)果顯示供試品溶液在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn):精密稱取山茱萸粗粉5份(每份5 g)，照樣品處理方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸含量的 RSD分別為 2.22%和 1.99%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn):分別精密稱取已知含量(齊墩果酸含量0.399 mg/g，熊果酸含量1.42 mg/g)的山茱萸粗粉6份，每份約2.5 g，平均分成3組，依次加入一定量的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品，按樣品處理方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 齊墩果酸與熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.3 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的山茱萸，60℃下干燥至恒重，粉碎過20目篩，分別稱取5 g，按樣品處理方法處理，每個(gè)樣品平行制備3份，測(cè)定齊墩果酸、熊果酸含量，取平均值，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地山茱萸中齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

山茱萸是各成藥方中的臣藥，主要含有齊墩果酸、熊果酸、蘋果酸、沒食子酸等[3]。其中熊果酸能明顯降低血糖、尿糖[4－5]，齊墩果酸有較強(qiáng)的抑菌、強(qiáng)心、利尿和保肝作用[6]，這兩個(gè)成分是山茱萸的主要指標(biāo)成分。2000年版《中國藥典(一部)》山茱萸項(xiàng)下對(duì)熊果酸的含量測(cè)定采用薄層掃描法[7]，但由于熊果酸和齊墩果酸均屬于三萜酸，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上又是異構(gòu)體，且兩者極性幾乎無區(qū)別，在薄層板上應(yīng)用藥典中的條件無法分離開。目前文獻(xiàn)報(bào)道中，多數(shù)未將齊墩果酸與熊果酸分離，測(cè)得量實(shí)際為二者之和[8－9]。且這兩種成分在天然植物中似乎又是共存的[10]。本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，使兩者成分分離是試驗(yàn)難點(diǎn)。流動(dòng)相的選擇是關(guān)鍵，采用乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)作為流動(dòng)相，在反相柱上，甲醇比例增減對(duì)兩者分離與保留均有較大影響，增加適量的磷酸，使它產(chǎn)生弱酸性環(huán)境，既有利于兩種三萜酸分離，又改善了峰形。

本試驗(yàn)首次采集了來自不同產(chǎn)地的山茱萸樣品，且同時(shí)測(cè)定了樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量，這為山茱萸在成藥制劑中藥材的選擇提供了一個(gè)可靠、科學(xué)的依據(jù)。本試驗(yàn)還首次利用PDA檢測(cè)器對(duì)所定量的4個(gè)組分色譜峰進(jìn)行識(shí)別和純度分析，通過樣品中色譜峰和對(duì)照品紫外光譜圖對(duì)照和純度角證明，所測(cè)成分純度很高，定量準(zhǔn)確，從而也證明了文中所優(yōu)化的色譜條件是可行的。

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[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1990:19.

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