沈?qū)氃?，劉玉匯，張俊蓮＊，王蒂＊

（1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

淀粉是高等植物光合產(chǎn)物主要儲(chǔ)存形式。淀粉合成酶是調(diào)控淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，它催化形成α－1，4－糖苷鍵，將ADP葡萄糖連接在α－1，4－葡聚糖的非還原端，延長α－1，4－葡聚糖鏈［1］。淀粉合成酶以2種形式存在，即顆粒結(jié)合淀粉合成酶（granule－bound starch synthase，GBSS）和可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS），并具多種同工型。根據(jù)其編碼基因的cDNA序列和以此推定的氨基酸序列的同源性差異將其分為：GBSSⅠ、GBSSⅡ、SSSⅠ、SSSⅡ、SSSⅢ等，其中GBSSⅠ又稱 Waxy蛋白，在淀粉貯存組織中對直鏈淀粉的合成起關(guān)鍵作用［2］。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是營養(yǎng)豐富、用途廣泛的作物，除糧菜兼用外，其在食品加工、淀粉加工等方面的作用更為重要。目前，馬鈴薯淀粉的生產(chǎn)量和商品量僅次于玉米淀粉，是位居第2的植物淀粉［3］。馬鈴薯淀粉中，直鏈淀粉約占20%～25%，支鏈淀粉約占75%～80%，其淀粉含量及其直／支鏈淀粉比例是影響馬鈴薯加工淀粉的產(chǎn)量及其在食品加工、造紙、化工等工業(yè)中的用途［4］。直鏈淀粉含量越高，分子間易結(jié)合，易發(fā)生凝沉，糊化越難［5，6］，可用于膠片和膠條的制造，且該類膠片（條）具有突出的透明度、彈性、抗拉強(qiáng)度和抗水性。高直鏈淀粉也是生產(chǎn)光解塑料的最佳原料，是解決“白色污染”的有效途徑。高支鏈淀粉則具有較好的穩(wěn)定性、溶解性、粘滯性和透明性，適于作增稠預(yù)制劑、乳化劑、粘著劑等，被廣泛用于香腸、湯羹類罐頭、冷凍食品、膨化食品等食品添加劑，也在造紙、紡織、建筑、石油化工等方面具有廣泛用途［7，8］。因此，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯GBSS I基因的過量表達(dá)或抑制表達(dá)，是改變馬鈴薯淀粉結(jié)構(gòu)、獲得高直鏈淀粉或高支鏈淀粉新品種、開拓馬鈴薯淀粉應(yīng)用新領(lǐng)域的最有效途徑。本研究利用RT－PCR技術(shù)（方法逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)，reverse transcription－polymerase chain reaction）從馬鈴薯塊莖中克隆到GBSSⅠ基因的cDNA序列，同時(shí)利用基因和蛋白數(shù)據(jù)庫資料對該序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行功能分析，為其進(jìn)一步利用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 馬鈴薯四倍體栽培種“甘農(nóng)薯2號(hào)”的微型薯，由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）提供。整個(gè)試驗(yàn)于2007年5月至2008年12月在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、p GEM?－T Easy Vector［抗性標(biāo)記為氨芐青霉素（Ampr）］，購自Promega公司。

1.1.3 酶和試劑 各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；PureLinkTMPlant RNA Reagent、SuperscriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen（英杰）生命技術(shù)有限公司（以下簡稱Invitrogen公司）；DNA凝膠回收試劑盒購自北京天為時(shí)代公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank（accession number X58453）中馬鈴薯GBSSⅠ基因序列，設(shè)計(jì)1對引物，即上游引物p1：5′－CGCTCGAG （XhoI）ATGGCAAGCATCACAGCTTCACAC－3′，下游引物 p2：5′－CGGGATCC（Bam HI）GGGAGTGGCTACATTTTCCTTGGC－3′，由北京賽百盛公司合成。

1.2 GBSS I基因的cDNA克隆

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA第1鏈 1）總RNA提取。利用Pure LinkTMPlant RNA Reagent試劑盒抽提馬鈴薯塊莖總RNA，重復(fù)5次。提取方法見試劑盒說明書。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按文獻(xiàn)［9］的有關(guān)要求進(jìn)行，防止RNase污染。提取的總RNA在經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的l%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠（EB）染色后檢查RNA的完整性；2）cDNA第1鏈合成。利用SuperscriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，其中以O(shè)ligo（d T）20為引物，在 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成c DNA第1鏈，具體操作過程見試劑盒說明書。3）保存。－20℃下保存cDNA第1鏈。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以p1和p2為引物，在Taq DNA聚合酶作用下，克隆GBSSⅠ基因的cDNA序列，重復(fù)5次。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，由2μL cDNA 摸板、2.5μL 10×buffer、1μL d NTP（10 mmol／L）、1μL引物p1（10 mmol／L）、1μL引物p2（10 mmol／L）、0.5μL Taq DNA聚合酶、17μL dd H2O組成。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性1 min后，進(jìn)行94℃50 s、53℃50 s、72℃2 min的35個(gè)循環(huán)，再在72℃下延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物EB染色后在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.3 cDNA序列與T載體連接 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，回收方法見試劑盒說明書?；厥债a(chǎn)物與p GEM?－T Easy Vector載體連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，連接和轉(zhuǎn)化方法見試劑盒說明，重復(fù)10次。

1.2.4 重組質(zhì)粒的獲得 將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含50μg／m L Ampr、l00μL（20 mg／m L）5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（X－gal）和12μL（0.8 mol／L）異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對所獲得的白斑通過滯后質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增、XhoI和Bam HI雙酶切鑒定，重復(fù)10次，－80℃下保存。

1.3 序列測定及分析

送白斑菌株到上海生工公司測序，重復(fù)10次。所測序列用Lynnon biosoft公司的DNAMAN version 6.0軟件進(jìn)行分析。然后通過NCBI網(wǎng)站的Blast X和Blast P程序進(jìn)行序列相似性分析和氨基酸保守性預(yù)測；用ClustalW2網(wǎng)站的軟件進(jìn)行氨基酸序列比對和相似序列進(jìn)化樹分析；鏈接至http：／／au.expasy.org／prosite網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；用PredictProtein Server網(wǎng)站的軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；將GBSSⅠ氨基酸序列提交至Phyre網(wǎng)站，進(jìn)行GBSSⅠ蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及比對分析，并用Rasmol 2.6軟件查看GBSSⅠ三級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖1 馬鈴薯總RNAFig.1 Total RNA of S.tuberosum

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖GBSSⅠ基因的cDNA克隆

馬鈴薯塊莖由于富含多糖和酚類物質(zhì)，其RNA提取難度較大。本研究用Invitrogen公司的Pure－LinkTMPlant RNA Reagent提取試劑盒進(jìn)行塊莖總RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，總RNA的5 S，18 S和28 S三條帶清晰、完整（圖1），表明RNA的完整性良好，說明該試劑盒適合馬鈴薯塊莖的總RNA提取。利用cDNA第1鏈合成試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV的作用下，獲得了馬鈴薯塊莖的cDNA第1鏈。根據(jù)已發(fā)表的馬鈴薯GBSSⅠ基因序列，利用設(shè)計(jì)的1對特異性引物，以cDNA第1鏈為模板，在Taq DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，期望獲得約1 824 bp大小的DNA片段。對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢查結(jié)果表明，其大小與預(yù)期片段基本一致（圖2），說明可能獲得了GBSSⅠ基因的cDNA克隆。

2.2 重組質(zhì)粒的獲得

將擴(kuò)增獲得的GBSSⅠ基因片段與T載體連接。藍(lán)白斑篩選后，進(jìn)行滯后質(zhì)粒篩選（圖3），然后利用PCR及XhoI和Bam HI雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增到或切下約1 824 bp大小的DNA片段（圖4a，b），將其定義為p GBSS－T。

圖2 馬鈴薯GBSS I基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of GBSSⅠgene

圖3 T－載體上滯后質(zhì)粒的篩選Fig.3 Identification of delayed plasmid of T－vector

圖4 白斑滯后質(zhì)粒的PCR及Bam HI和XhoI酶切鑒定Fig.4 Identification of white color plasmid by PCR，Bam HI and XhoI

2.3 GBSSⅠ基因的cDNA序列及蛋白序列分析

2.3.1 GBSSⅠ基因的cDNA序列分析 將p GBSS－T質(zhì)粒交上海生工公司測序。測序結(jié)果與原序列（accession number X58453）比較后發(fā)現(xiàn)，二者同源性達(dá)99.78%，其開放閱讀框架為1 824 bp，編碼607個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子（TAA）（圖5）。將該基因登記在GenBank中，登錄號(hào)為EU403426。

圖5 馬鈴薯GBSSⅠ基因的cDNA序列及其推測的氨基酸序列Fig.5 Nucleotide sequence and deduced amino sequence of GBSSⅠ cDNA of S.tuberosum

用DNAMAN軟件對該序列與GenBank中登記的部分物種的GBSSⅠ基因的cDNA序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列與其他學(xué)者登錄的馬鈴薯GBSSⅠ基因的同源性很高，達(dá)99.20%以上，但與其他科植物同源性較低，為59%～77%。其中，與旋花科甘薯和大戟科木薯的同源性較高，其次為豆科類作物，而與禾本科作物的同源性較低（表1），說明同科植物特別是同種植物，該基因的保守性強(qiáng)，而不同科植物的GBSSⅠ基因間差異較大。

2.3.2 GBSSⅠ基因的蛋白質(zhì)序列特征分析 利用Blast P軟件在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）對包括該基因在內(nèi)的16種植物（10種雙子葉植物和6種單子葉植物）的蛋白保守區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了3個(gè)完全保守區(qū)，即Glycos＿transf（糖基轉(zhuǎn)移酶，glycosyl transferase）、glg A（糖原／淀粉合成酶，glycogen／starch synthases，ADP－glucose type）和 Glyco＿transf（淀粉合成酶催化區(qū)，starch synthase catalytic region），分別在97－101（GGLGD）、480－490（SRFEPCGLXQL）和503－510（STGGLVDT）氨基酸殘基處（圖5，6），表明這些區(qū)域具有十分重要的功能，如glg A為ADP＿葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)［10－13］。

表1 馬鈴薯GBSS基因cDNA與其他植物GBSS基因cDNA序列同源性比較Table 1 Alignment of nucleotide sequence of GBSS gene with other homologues

另外，該蛋白在第57－59，66－68，121－123，313－315，362－364，435－437，510－512和567－569處具有蛋白激酶C功能（圖5，用“——”表示），能將靶蛋白的Ser／thr磷酸化，從而激活細(xì)胞質(zhì)中某些酶的活性，參與生化反應(yīng)調(diào)控；還可與核中轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與基因表達(dá)調(diào)控。在第364－370氨基酸處（圖5，用“【】”表示），該蛋白具有1個(gè)酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，可將自身的酪氨酸磷酸化或?qū)⒏鞣N不同靶蛋白的酪氨酸磷酸化來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通常與細(xì)胞生長、繁殖、分化、生存有關(guān)。此外，該蛋白分別在第16－19，271－274，329－332，374－377，480－483，510－513，585－588個(gè)氨基酸殘基處還具有7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（圖5，用“｛｝”表示）；這是一種真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲／蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生存、生長、增殖及凋亡過程中具有重要的功能；位于第31－34和第213－216個(gè)氨基酸處具有2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)（圖5，用“?”表示），使蛋白質(zhì)能夠抵抗消化酶的作用、賦予蛋白質(zhì)傳導(dǎo)信號(hào)的功能、或某些蛋白只有在糖基化之后才能正確折疊；2個(gè)酰胺化位點(diǎn)，位于第299－302和第435－438個(gè)氨基酸處（圖5，用“□”表示）；7個(gè)N端?；稽c(diǎn)，分別在第70－75，105－110，250－255，309－314，348－353，506－511，581－586個(gè)氨基酸處（圖5，用“■”表示）。

圖6 馬鈴薯GBSSⅠ與其他植物GBSSⅠ基因氨基酸序列比較Fig.6 Alignment of amino acid sequence of GBSSⅠgene with other homologues

2.3.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過PredictProtein Server網(wǎng)站的相關(guān)軟件分析發(fā)現(xiàn)，組成GBSSⅠ蛋白的607個(gè)氨基酸中，169個(gè)氨基酸可能形成α螺旋結(jié)構(gòu)，115個(gè)氨基酸可能形成β折疊片，323個(gè)氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲。進(jìn)一步登錄Phyre網(wǎng)站，將GBSSⅠ氨基酸序列提交給CPHmodels和Phyre，用PSI－BLAST（位點(diǎn)特性反復(fù)BLAST）標(biāo)準(zhǔn)方法通過多序列比對建模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10個(gè)推薦模型。對其進(jìn)行比對分析后選取d1rzua（糖原合成酶，glycogen synthase 1）－Glg A fromAgrobacteriumtumefaciens［31%i.d.，E－value（E期望值）＝0，estimated precision（估計(jì)精度）＝100%］作為模板進(jìn)行GBSSⅠ蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，將Phyre網(wǎng)站返回的d1rzua模板和GBSSⅠ模型用Rasmol軟件查看，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者單體結(jié)構(gòu)十分相似（圖7，8），表明馬鈴薯GBSSⅠ蛋白與原核生物農(nóng)桿菌的淀粉合成酶可能具有相同的功能（圖6）。

圖7 d1ruza單體三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 The monomer 3D structure of d1ruza

圖8 GBSSⅠ預(yù)測單體三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 The predicted monomer 3D structure of GBSSⅠ

3 討論

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，反義GBSSⅠ基因或RNAi沉默GBSSⅠ基因，可顯著降低被干擾植株的直鏈淀粉含量，培育糯質(zhì)型作物新品種［14，15］；而增加GBSSⅠ基因的過量表達(dá)，則有望創(chuàng)制高直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)基因植株，培育膜用型作物新品種［16，17］，表明GBSSⅠ基因的過量表達(dá)或抑制表達(dá)是改變作物淀粉結(jié)構(gòu)、創(chuàng)制新型淀粉類型、培育專用型作物新品種的有效途徑。馬鈴薯GBSS基因有2種同工型，GBSSⅠ基因主要在貯藏器官塊莖中表達(dá)，負(fù)責(zé)直鏈淀粉合成，GBSSⅡ主要在莖葉等非貯藏器官中表達(dá)［18］，因此，分離并克隆控制馬鈴薯塊莖直鏈淀粉含量的GBSSⅠ基因的cDNA序列，是利用基因工程技術(shù)改良馬鈴薯淀粉結(jié)構(gòu)首先且必要的條件。

馬鈴薯GBSSⅠ基因?yàn)閱慰截?，?3個(gè)內(nèi)含子［19］，其cDNA序列提取方法與無內(nèi)含子基因的DNA提取方法不同［20］。本研究以Gen Bank中已公布序列（X58453）設(shè)計(jì)特異引物，利用RT－PCR和序列測定技術(shù)獲得了該基因的cDNA序列。分析比對后發(fā)現(xiàn)，其與已公布的馬鈴薯該基因的cDNA序列同源性很高，達(dá)99.20%以上，但與其他物種間的同源性較低，為59%～77%，說明同科植物特別是同種植物，該基因的保守性很強(qiáng)，這與其他研究者對不同基因或不同物種同源性分析時(shí)的結(jié)論是一致的，即屬內(nèi)同源性高，屬間相對低［21－23］。

生物信息學(xué)是一門發(fā)展迅速的新興科學(xué)，利用相關(guān)軟件可分析基因組或目的基因的序列特征、功能蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、分子遺傳圖譜的構(gòu)建等［23，24］，為利用功能基因改良作物遺傳特性奠定基礎(chǔ)。本研究對克隆到的GBSSⅠ基因的cDNA片段利用相關(guān)軟件進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其編碼607個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子，具3個(gè)與其他15種植物完全一樣的保守功能區(qū)域，存在著蛋白激酶C、酪氨酸蛋白激酶磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、糖基化、酰胺化和?；裙δ芪稽c(diǎn)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，其與農(nóng)桿菌淀粉合成酶具有十分相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，表明該蛋白具有淀粉合成功能。本研究為利用基因工程創(chuàng)制馬鈴薯新型淀粉結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

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