賈玉芳，陳曙，柴明良

（浙江大學(xué)園林研究所，浙江 杭州310029）

植物在組織培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)愈傷組織再生誘導(dǎo)的體細(xì)胞無(wú)性系會(huì)發(fā)生廣泛的變異，即體細(xì)胞無(wú)性系變異［1］，它來(lái)源于已存在的細(xì)胞變異和培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)的變異［2］。體細(xì)胞無(wú)性系突變體的篩選在草坪草抗逆性育種方面已經(jīng)取得了一些成果。Chai等［3］在結(jié)縷草（Zoysiajaponica）愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加褐斑病菌株（Rhizoctoniasolani，AG 2－2，Ⅳ）培養(yǎng)液，篩選出對(duì)褐斑病具有較高抗性的株系。Lu等［4，5］對(duì)三倍體狗牙根（Cynodontransvaalensis×C.dactylon）懸浮培養(yǎng)的再生植株進(jìn)行干旱脅迫，獲得了耐旱性較高的突變體；還通過(guò)愈傷組織抗NaCl篩選，獲得了三倍體狗牙根耐鹽性變異株系［6］。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，施加一定的誘變劑可以進(jìn)一步增加再生植株的變異頻率，獲得更多的變異材料。輻射誘變具有較高的變異頻率和變異范圍，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定遺傳的突變體，已在高羊茅（Festucaarundinaceae）［7］、狗牙根（C.dactylon）［8］、日本結(jié)縷草（Z.japonica）［9］等多種草坪草上有所應(yīng)用。輻射誘變與離體篩選相結(jié)合已經(jīng)成為一種重要的育種手段。

溝葉結(jié)縷草（Z.matrella）是一種廣泛應(yīng)用的優(yōu)良暖季型草坪草。它在自然界中通過(guò)匍匐莖無(wú)性繁殖，因此不能用雜交育種等傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行遺傳改良，而通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異等生物技術(shù)提高其抗逆性是一種有效的途徑。隨著世界范圍內(nèi)土壤鹽漬化問(wèn)題的加劇，關(guān)于草坪草耐鹽性的研究越來(lái)越受到重視［10，11］。研究表明，在自然界中溝葉結(jié)縷草是一種比較耐鹽的草坪草［12］，有望通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選獲得耐鹽性較強(qiáng)的突變體。雖然溝葉結(jié)縷草已經(jīng)通過(guò)莖尖誘導(dǎo)的叢生芽［13］以及幼花序和莖節(jié)［14］誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得了再生植株，但是關(guān)于其輻射誘變和耐鹽性離體篩選的研究，至今還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年的離體試驗(yàn)，已經(jīng)熟練掌握了以溝葉結(jié)縷草匍匐莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的技術(shù)，并且建立了高效的再生體系。本試驗(yàn)以溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織為試材，比較了0（對(duì)照）和10 Gy的60Coγ射線(xiàn)輻照對(duì)愈傷組織再生能力以及再生植株過(guò)氧化酶活性和脯氨酸含量的影響，并通過(guò)輻射后愈傷組織的抗NaCl篩選，獲得了在含1.0%NaCl的再生培養(yǎng)基上保持旺盛生長(zhǎng)的試管苗，旨在為溝葉結(jié)縷草的輻射誘導(dǎo)耐鹽性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導(dǎo)的胚性愈傷組織。

1.2 愈傷組織輻射處理

以 MS＋2.0 mg／L 2，4－D＋1.15 g／L脯氨酸＋40 g／L蔗糖＋5.3 g／L瓊脂粉的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的愈傷組織為材料，取生長(zhǎng)旺盛、均勻一致的胚性愈傷組織20皿，于2007年3月在浙江大學(xué)核農(nóng)所輻照中心進(jìn)行60Co急性照射。輻射劑量分0（對(duì)照）和10 Gy 2個(gè)梯度水平，每種輻射劑量各處理10皿。輻射后的愈傷組織在（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)。

1.3 愈傷組織再生能力的測(cè)定

輻射后，取一部分愈傷組織進(jìn)行再生能力的測(cè)定。再生培養(yǎng)基為1／2MS（大量元素減半）＋0.1 mg／L BA＋30 g／L蔗糖＋5.3 g／L瓊脂粉。以直徑約3 mm的愈傷組織小塊為外植體，每皿接種16小塊，每輻射劑量設(shè)5皿重復(fù)，于光強(qiáng)約12.5μmol／（m2·s），每天光照12 h，（25±2）℃條件下培養(yǎng)。愈傷組織再生過(guò)程中顏色由黃轉(zhuǎn)綠，膨大生長(zhǎng)，表面產(chǎn)生綠色瘤狀突起，并分化形成綠色的小苗。4周后觀(guān)察其再生情況。測(cè)量每塊外植體的直徑，大多數(shù)外植體直徑在5 mm以上，因此以5 mm作為衡量其再生速度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，直徑超過(guò)5 mm的外植體比率越高，則表明其生長(zhǎng)速度越快。同時(shí)統(tǒng)計(jì)分化形成3個(gè)以上小苗的外植體比率和愈傷組織再生率（再生的愈傷組織塊數(shù)／總愈傷組織塊數(shù)）。用上述3個(gè)指標(biāo)綜合衡量愈傷組織的再生能力。

1.4 再生植株CAT、SOD、POD活性和脯氨酸含量測(cè)定

將上述再生植株移栽到溫室，8周后長(zhǎng)成生長(zhǎng)旺盛的成熟植株。取不同輻射處理的再生植株幼嫩葉片0.2 g，加3 m L 50 mmol／L的磷酸緩沖液（p H 7.8，含0.2 mmol／L乙二胺四乙酸，1%聚乙烯吡咯烷酮），于冰浴中研磨提取，勻漿液于4℃下12 000 r／min離心20 min，取上清液用于過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。CAT活性測(cè)定參照Lu等［6］的方法；SOD活性測(cè)定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光還原法［15］；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［16］；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法［15］。采用UV－2550型分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司生產(chǎn)）測(cè)定吸光度，計(jì)算各指標(biāo)的含量。

1.5 愈傷組織抗鹽篩選

輻射處理的愈傷組織經(jīng)過(guò)4周繼代培養(yǎng)后進(jìn)行抗鹽篩選。取直徑約3 mm的愈傷組織小塊，接種到分別添加了0%，0.5%，1.0%，1.5%和2.0%NaCl的再生培養(yǎng)基上，每皿接種16小塊，每個(gè)處理設(shè)5皿重復(fù)，于光強(qiáng)約12.5μmol／（m2·s），每天光照12 h，（25±2）℃條件下培養(yǎng)。8周后觀(guān)察其再生情況。由于在含鹽的培養(yǎng)基上再生較慢，大部分外植體直徑在4 mm以上，因此以直徑超過(guò)4 mm的外植體比率作為衡量再生速度的標(biāo)準(zhǔn)之一。同時(shí)統(tǒng)計(jì)外植體的存活率（具有再生能力的綠色外植體塊數(shù)／總外植體塊數(shù)）和成苗率（再生形成小苗的外植體塊數(shù)／總外植體塊數(shù)）。用上述3個(gè)指標(biāo)綜合衡量愈傷組織的耐鹽性。之后將所有再生形成的小植株轉(zhuǎn)移到含1.0%NaCl的1／2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.6 數(shù)據(jù)差異顯著性分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SAS分析軟件，Tukey多重比較法，5%水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射處理對(duì)愈傷組織再生的影響

2.1.1 愈傷組織再生能力比較 0 Gy60Coγ射線(xiàn)處理對(duì)愈傷組織再生分化成苗的速度有顯著的促進(jìn)作用（圖1）。同對(duì)照相比，10 Gy輻射處理的愈傷組織再生4周后分化形成3個(gè)以上小苗的比率提高11.25%，但是再生率降低8.75%，2項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到顯著水平。不同輻射劑量對(duì)于直徑超過(guò)5 mm的愈傷組織比率沒(méi)有顯著影響。

2.1.2 再生植株CAT、SOD、POD活性和脯氨酸含量變化 10 Gy60Coγ射線(xiàn)處理后，再生植株葉片中的CAT活性和脯氨酸含量分別比對(duì)照提高16.02%和1.20倍（圖2A，D），均達(dá)到顯著水平。而不同處理的SOD和POD活性沒(méi)有顯著差異（圖2B，C），分別在2.74～2.78 U／（g FW·min）之間和12.77～13.09 U／（g FW·min）之間。

2.2 輻射處理的愈傷組織抗鹽篩選

隨著NaCl濃度的升高，外植體的生長(zhǎng)速度（直徑≥4 mm的外植體比率）和存活率呈逐漸下降的趨勢(shì)（圖3A，B），并且任意2種NaCl濃度之間的差異達(dá)到顯著水平。與0 Gy相比，在含0.5%～2.0%NaCl的再生培養(yǎng)基上，10 Gy60Coγ射線(xiàn)處理的愈傷組織具有更快的生長(zhǎng)速度和更高的存活率，說(shuō)明愈傷組織的耐鹽性有所提高。

不同NaCl濃度對(duì)于再生成苗率也有顯著影響（圖3C）。NaCl濃度為0%時(shí)，再生成苗率最高，為32.00%～35.20%。除此以外，10 Gy處理的愈傷組織在含1.0%NaCl的再生培養(yǎng)基上再生成苗率最高（9.60%），所獲得的再生植株生長(zhǎng)較快（圖4A），在轉(zhuǎn)移到含1.0%NaCl的生根培養(yǎng)基上后仍保持著旺盛生長(zhǎng)（圖4C）。未經(jīng)輻射（0 Gy）的愈傷組織只在含0.5%和1.0%NaCl的再生培養(yǎng)基獲得少量生長(zhǎng)緩慢的再生植株（圖4B）。當(dāng)NaCl濃度提高到2.0%時(shí)，0和10 Gy處理的愈傷組織均沒(méi)有形成再生植株。

圖1 輻射處理對(duì)愈傷組織再生的影響Fig.1 Effects of different radiation treatments on regeneration of the calluses

3 討論

輻射誘變結(jié)合離體培養(yǎng)定向篩選突變體是一種快速有效的育種方法。藏威等［17］通過(guò)60Coγ射線(xiàn)輻射誘變，采用稻瘟病菌（Pyriculariagrisea）粗毒素提取液作為選擇壓力，篩選出水稻（Oryzasativa）抗瘟突變體。甜菜（Betavulgaris）叢生芽經(jīng)過(guò)γ射線(xiàn)輻射后，在含NaCl的培養(yǎng)基上篩選獲得了耐鹽性的甜菜幼苗［18］。通常認(rèn)為，愈傷組織體細(xì)胞胚胎發(fā)生是單細(xì)胞起源的，因此以愈傷組織為輻射對(duì)象，通過(guò)定向篩選獲得有利突變體的方法能夠減少嵌合體的產(chǎn)生，獲得穩(wěn)定遺傳的變異。本試驗(yàn)首次以溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織為試材，通過(guò)60Coγ射線(xiàn)處理，在含1.0%NaCl的再生培養(yǎng)基上，篩選出生長(zhǎng)良好的抗性植株，在溝葉結(jié)縷草的輻射誘變和抗鹽性篩選方面做出了初步探索。

圖2 輻射處理對(duì)再生植株生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of different radiation treatments on physiological indexes in the regenerated plants

圖3 不同輻射處理對(duì)愈傷組織耐鹽性的影響Fig.3 Effects of different radiation treatments on salt tolerance of the calluses

圖4 輻射處理的愈傷組織在含NaCl培養(yǎng)基上獲得的再生植株Fig.4 Regenerated plants acquired from calluses in different radiation treatments on medium with NaCl

在先前的試驗(yàn)中，通過(guò)比較不同劑量（0，5，10，20，40 Gy）60Coγ射線(xiàn)對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)10和20 Gyγ射線(xiàn)處理后，愈傷組織的生長(zhǎng)與再生速度均有明顯提高。故本試驗(yàn)以10 Gy作為輻射劑量，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行愈傷組織抗鹽性研究。試驗(yàn)中，10 Gy60Coγ射線(xiàn)處理雖然使愈傷組織再生率有所降低，但是對(duì)愈傷組織的再生速度卻有顯著的促進(jìn)作用，這與張慧琴等［19］關(guān)于草莓（Fragariaananassa）花藥愈傷組織輻射研究的結(jié)果一致。同時(shí)，10 Gy輻射處理能大大提高再生植株葉片內(nèi)的CAT活性和脯氨酸含量。而與之相對(duì)應(yīng)的是輻射處理后愈傷組織對(duì)NaCl的抗性有顯著增強(qiáng)。

鹽脅迫條件下，植物細(xì)胞通過(guò)脯氨酸等小分子有機(jī)物參與滲透調(diào)節(jié)來(lái)維持低的細(xì)胞質(zhì)滲透勢(shì)，以利于水分的吸收，保證細(xì)胞正常的生理功能。在正常生長(zhǎng)條件下，通過(guò)離體篩選獲得的耐鹽性三倍體狗牙根株系體內(nèi)脯氨酸含量高于親本，說(shuō)明較高的脯氨酸含量能提高植物對(duì)鹽害的適應(yīng)能力，減少在鹽脅迫下的傷害［6］。逆境條件下，植物細(xì)胞會(huì)積累大量活性氧（O2－、H2O2、OH－等），造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷和細(xì)胞氧化，使植物受到傷害［20］。為避免這種傷害，植物形成了內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)，通過(guò)SOD、POD和CAT等重要的保護(hù)酶清除體內(nèi)的活性氧，維持細(xì)胞的穩(wěn)定和完整，提高對(duì)逆境的適應(yīng)性［21］。與正常生長(zhǎng)條件下的敏感栽培品種相比，水稻耐鹽性品種具有較高的CAT活性，而在鹽脅迫條件下，耐鹽性或敏感性品種的CAT活性均有顯著增加［22］。而Lu等［6］的研究也表明，2個(gè)離體篩選獲得的耐鹽性三倍體狗牙根株系，在鹽脅迫條件下具有較高的CAT活性，說(shuō)明CAT活性與植物的耐鹽性呈正相關(guān)。因此，輻射處理的愈傷組織抗鹽性增強(qiáng)，與輻射再生植株CAT活性和脯氨酸含量的提高有著密切關(guān)系。

試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)10 Gyγ射線(xiàn)處理的愈傷組織，在含NaCl的再生培養(yǎng)基上能夠獲得生長(zhǎng)旺盛的抗性植株。這些植株在轉(zhuǎn)移到含1.0%NaCl的生根培養(yǎng)基上后，依然表現(xiàn)出良好的長(zhǎng)勢(shì)和較強(qiáng)的抗性。這說(shuō)明，輻射誘變結(jié)合離體篩選在溝葉結(jié)縷草耐鹽性育種方面是一種可行的方法。

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