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(1.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310014;2.浙江省長三角生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究園,浙江 德清 313200)

L-脯氨酸(L-proline)是一種結(jié)構(gòu)上帶有五元環(huán)的天然氨基酸,其五元環(huán)上的3,4,5位都可以被羥基化形成羥基脯氨酸,每個(gè)位置的羥基化又包含了順式和反式兩種結(jié)構(gòu),相應(yīng)的共有6種不同構(gòu)型的脯氨酸衍生物,包括順式-3-羥基-L-脯氨酸、反式-3-羥基-L-脯氨酸、順式-4-羥基-L-脯氨酸、反式-4-羥基-L-脯氨酸、順式-5-羥基-L-脯氨酸和反式-5-羥基-L-脯氨酸.其中,反式-4-羥基-L-脯氨酸是天然存在于動(dòng)物膠原蛋白中的一種L-脯氨酸羥基化衍生物[1],在幾種羥基化產(chǎn)物中存在最廣泛,因此通常將反式-4-羥基-L-脯氨酸簡稱為羥基脯氨酸,筆者將對(duì)羥基脯氨酸的性質(zhì)、功能、用途和生產(chǎn)方式加以詳細(xì)論述.

1 羥基脯氨酸的性質(zhì)

反式-4-羥基-L-脯氨酸,呈白色片狀晶體或粉末,分子式C5H9NO3,分子量為131.10,常溫常壓下較穩(wěn)定,極微溶于乙醇,不溶于乙醚,25 ℃時(shí)在水中的溶解度為361.1 g/L.羥基脯氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

2 羥基脯氨酸的代謝、功能和應(yīng)用

2.1 生物體內(nèi)羥基脯氨酸的代謝

生物體中膠原蛋白的脯氨酸殘基在氧氣、抗壞血酸、α-酮戊二酸和亞鐵離子存在的情況下,可被脯氨酰4-羥化酶催化生成相應(yīng)的羥基脯氨酸[2],生物體內(nèi)游離的4-羥基脯氨酸由膠原蛋白降解產(chǎn)生[3].人體內(nèi)源性膠原蛋白每天能產(chǎn)生300～450 mg的羥基脯氨酸,另外的羥基脯氨酸來源于飲食[4].大部分羥基脯氨酸在肝臟和腎臟中代謝,少于30 mg的羥基脯氨酸通過尿液排出體外[5].大型哺乳動(dòng)物中羥基脯氨酸的分解代謝途徑涉及4種線粒體酶[6]:羥脯氨酸氧化酶(HPOX)、D1-吡咯啉-5-羧酸酯脫氫酶(1P5CDH)、谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspAT)和4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶(HOGA).前3種酶負(fù)責(zé)將羥基脯氨酸環(huán)氧化成D1-吡咯啉-5-羧酸酯、自發(fā)開環(huán)和進(jìn)一步氧化生成4-羥基-谷氨酸,并將4-羥基-谷氨酸轉(zhuǎn)化為4-羥基-2-酮戊二酸(HOG),在4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶催化下,HOG被分解產(chǎn)生丙酮酸和乙醛酸[7].羥脯氨酸的代謝過程為

2.2 羥基脯氨酸的生理功能

羥基脯氨酸是一種非必需氨基酸,主要存在于動(dòng)物的膠原蛋白中[1],其作用是加強(qiáng)結(jié)締組織的彈性和韌性[2].膠原蛋白的螺旋區(qū)域是由多個(gè)Gly-X-Y的重復(fù)序列組成的,其中脯氨酸可以在X或Y位置,而羥脯氨酸僅存在于Y的位置上[8],其羥基有助于膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[9].脯氨酸的羥基化反應(yīng)也發(fā)生在其他蛋白質(zhì)中以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧的生理反應(yīng)[10].近年來的研究發(fā)現(xiàn):羥基脯氨酸在維持植物、動(dòng)物和人類細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用.比如,在動(dòng)物體內(nèi)羥基脯氨酸代謝生成的乙醛酸可以在丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的催化下生成雞所必需的甘氨酸[11].羥基脯氨酸是細(xì)胞代謝的重要調(diào)節(jié)劑,能夠提高體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)利用效率和改善生物體的健康,當(dāng)一些氨基酸前體的常用來源不可利用時(shí),羥脯氨酸可以在微環(huán)境中為氨基酸代謝途徑提供所需要的內(nèi)源性營養(yǎng)[3].

2.3 羥基脯氨酸的應(yīng)用

由于特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能,羥基脯氨酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、美容和疾病診斷等方面.

在醫(yī)藥方面,羥基脯氨酸作為起始原料,可以用來合成多種碳青霉烯類抗生素[12],如美羅培南、厄他培南等,此類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、毒性及耐藥性低、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定等特點(diǎn),對(duì)于某些頭孢類抗生素?zé)o法治愈的感染,培南類藥物具有良好的效果[13].鄭子新等發(fā)現(xiàn)以羥脯氨酸為重要組份研制的注射液對(duì)急慢性肝病所導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定的療效[14].羥基脯氨酸合成厄他培南的路徑為

在手性合成方面,羥基脯氨酸作為手性化合物可以經(jīng)催化合成多聚物[15],用來分離手性物質(zhì).2015年,研究人員將反式-4-羥基-L-脯氨酸鍵合手性配體制作成色譜固定相,在高效液相色譜中顯示可以拆分7種手性化合物、氯酚及二硝基苯兩種位置異構(gòu)體[16].

在美容方面,羥脯氨酸具有消除氧化劑和調(diào)整細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的潛在效果[17],有人將羥脯氨酸或N-?；u脯氨酸衍生物用于一些高端護(hù)膚品中[18].

在疾病診斷方面,羥脯氨酸是結(jié)締組織中唯一特征氨基酸,在膠原降解期間,尿和血清中釋放羥脯氨酸的含量與纖維化呈現(xiàn)相關(guān)性,在肝疾病診斷中可將羥脯氨酸含量用作纖維化評(píng)分的診斷標(biāo)志[19].此外研究還發(fā)現(xiàn)肌肉骨骼系統(tǒng)損害與尿中羥脯氨酸排泄量有一定關(guān)系[20],在體內(nèi)檢測(cè)尿液中羥脯氨酸的量是判斷組織中膠原蛋白損傷的一個(gè)生化指標(biāo)[21].

3 羥基脯氨酸的生產(chǎn)方法

羥基脯氨酸的生產(chǎn)方法主要有動(dòng)物組織提取法、全細(xì)胞催化法和直接發(fā)酵法.

3.1 動(dòng)物組織提取法制備羥基脯氨酸

提取法主要以動(dòng)物膠原蛋白為原料,經(jīng)過強(qiáng)酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程獲得羥基脯氨酸.李娟等以明膠為原料,用鹽酸水解,亞硝酸鈉氧化,D61大孔徑陽離子交換樹脂分離提取,濃縮結(jié)晶后羥基脯氨酸的提取率平均值達(dá)到41.4%[22],水解法提取羥基脯氨酸的工藝簡單、技術(shù)門檻低,但強(qiáng)酸水解膠原蛋白容易造成氨基酸的消旋變性,影響產(chǎn)物的品質(zhì).同時(shí)廢水排放多,環(huán)保壓力大,目前已基本上被淘汰,其工藝路線為

3.2 全細(xì)胞催化法

L-脯氨酸-4-羥化酶能夠以L-脯氨酸、α-酮戊二酸和氧氣為底物,催化生成羥基脯氨酸、琥珀酸和二氧化碳.全細(xì)胞催化法和直接發(fā)酵法都是以該酶為基礎(chǔ)建立起來的.通常將需要添加L-脯氨酸為底物生產(chǎn)羥基脯氨酸的方法定義為全細(xì)胞催化法,將以葡萄糖等初級(jí)碳源直接發(fā)酵生產(chǎn)羥基脯氨酸的方法定義為直接發(fā)酵法.

1994年研究者通過對(duì)灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseoviridus)的L-脯氨酸-4-羥化酶對(duì)α-酮戊二酸依賴性的特異性研究,首次使生物法生產(chǎn)羥基脯氨酸成為可能[23].但是由于酶的不穩(wěn)定性及難于提取分離等特點(diǎn),一直限制著體外羥基脯氨酸的合成.

20世紀(jì)末,Shibasaki等采用高效靈敏的篩選系統(tǒng),篩選出具有脯氨酸-4-羥化酶活性的指孢囊菌RH1(Dactylosporangiumsp.),從該菌株中分離純化得到到反式-4-脯氨酸羥化酶,該酶能夠在體外催化L-脯氨酸羥基化生成游離的反式-4-羥基-L-脯氨酸,其特點(diǎn)是具有高度的區(qū)域和立體特異性.研究人員將表達(dá)反式-4-脯氨酸羥化酶的基因克隆并在大腸桿菌中表達(dá),大腸桿菌重組體顯示脯氨酸-4-羥化酶活性,比原始菌株指孢囊菌中的活性高13.6倍[24].脯氨酸-4-羥化酶催化過程為

由于α-酮戊二酸價(jià)格較高,因此直接以L-脯氨酸和α-酮戊二酸為底物,催化生成羥基脯氨酸的方案成本過高.所以全細(xì)胞催化合成羥基脯氨酸一般只添加外源的L-脯氨酸,而α-酮戊二酸是通過培養(yǎng)過程中TCA循環(huán)來供應(yīng).Shibasaki等將L-脯氨酸羥化酶在大腸桿菌W1485中表達(dá),在含有L-脯氨酸和葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)100 h產(chǎn)生并累積41 g/L的羥基脯氨酸,使L-脯氨酸到羥基脯氨酸的轉(zhuǎn)化率為87%.在此基礎(chǔ)上,該課題組進(jìn)一步敲除了大腸桿菌W1485菌株中的putA基因,阻斷了L-脯氨酸到谷氨酸的代謝途徑,雖然同樣條件下羥基脯氨酸的最終產(chǎn)量還是41 g/L,但L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率從原來的87%提高到100%[25].此外,全細(xì)胞催化法合成羥基脯氨酸的研究主要從反式-4-脯氨酸羥化酶基因序列入手,通過添加分子伴侶、優(yōu)化反式-4-脯氨酸羥化酶基因序列等[26-27]來提高反式-4-脯氨酸羥化酶的酶活.例如,劉合棟等對(duì)脯氨酸-4-羥化酶基因優(yōu)化與強(qiáng)啟動(dòng)子串聯(lián)得到高表達(dá)的脯氨酸羥化酶[28],經(jīng)過添加外源L-脯氨酸和發(fā)酵條件的優(yōu)化,羥基脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了42.5 g/L[29].表1是不同全細(xì)胞催化法合成羥基脯氨酸的總結(jié)對(duì)比.

表1 不同全細(xì)胞催化法合成羥基脯氨酸的總結(jié)Table 1 Summary of hydroxyproline synthetise by different whole cell catalysis

注:1) 色氨酸啟動(dòng)子;2) 敲除L-脯氨酸脫氫酶基因;3) 脯氨酸-4-羥化酶;4) pUC19質(zhì)粒;5) 透明顫酸血紅蛋白基因;6) pAMP質(zhì)粒.

近年來不少研究者對(duì)不同來源的酶做了對(duì)比研究.Yi等將不同來源的脯氨酸-4-羥化酶基因克隆至大腸桿菌中,發(fā)現(xiàn)來源于指孢囊菌的脯氨酸-4-羥化酶表達(dá)的酶活性最高[32].表2是不同來源的脯氨酸4-羥化酶在不同宿主菌中的酶學(xué)活性對(duì)比,其中酶活為1 min催化脯氨酸生成1 nmol Hyp所需的酶量;比酶活是每毫克濕細(xì)胞的酶活.結(jié)果顯示來源于指孢囊菌的酶在大腸桿菌中表達(dá)酶活最高;隨后在研究脯氨酸的添加量對(duì)產(chǎn)量的影響實(shí)驗(yàn)中得出:在添加4 mmol/L的脯氨酸時(shí)羥基脯氨酸的質(zhì)量濃度最高(6.72 g/L).周海巖等為了提高脯氨酸羥基化酶的酶活將來源于根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的反式-4-脯氨酸羥化酶基因p4hBJ(GenBankNO.BAL06808.1)進(jìn)行序列優(yōu)化和設(shè)計(jì),在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),全細(xì)胞催化反應(yīng)22 h后,羥基脯氨酸的的質(zhì)量濃度達(dá)到34.86 mg/L[33].

表2 不同來源的脯氨酸-4-羥化酶在不同宿主菌中的活性對(duì)比Table 2 Comparison of the activity of proline-4-hydroxylase from different sources in different strains

3.3 直接發(fā)酵法

全細(xì)胞催化法合成羥基脯氨酸需要額外添加L-脯氨酸做底物,增加了生產(chǎn)成本.在此基礎(chǔ)上,研究人員把L-脯氨酸的生物合成途徑與反式-4-羥脯氨酸的合成途徑結(jié)合起來,構(gòu)建高產(chǎn)羥脯氨酸的工程菌,在不需要額外添加L-脯氨酸的前提下,能夠以廉價(jià)的葡萄糖為原料,通過液體發(fā)酵,在微生物體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)化生成反式-4-羥脯氨酸,合成途徑為

2000年,Shibasaki將脯氨酸-4-羥化酶基因與抗反饋抑制的γ-谷氨酰激酶proB基因和γ-谷氨酰磷酸還原酶proA基因一起在大腸桿菌W1485/ΔputA中表達(dá),以葡萄糖為碳源,發(fā)酵96 h產(chǎn)生25 g/L的羥基脯氨酸,由于不用額外添加L-脯氨酸,因此生產(chǎn)成本更低[34].近年來,國內(nèi)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)羥基脯氨酸的研究也日益增多,主要是以大腸桿菌為宿主菌,根據(jù)羥基脯氨酸的代謝途徑進(jìn)行改造.2015年胡丹丹等通過對(duì)大腸桿菌谷氨酸激酶突變得到突變基因proBA2,降低L-脯氨酸對(duì)谷氨酸激酶的反饋抑制作用,通過搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.22 g/L[35].盛花開等首次將proB,proA,proC和p4h4個(gè)基因在同一質(zhì)粒上表達(dá),在不添加脯氨酸時(shí),搖瓶發(fā)酵Hyp的質(zhì)量濃度為0.16 g/L[36].表3是不同基因工程菌產(chǎn)羥基脯氨酸的含量對(duì)比.2017年,王曉姣等以E.coliBL21(DE3)ΔputA為出發(fā)菌株,利用基因敲除技術(shù)阻斷L-谷氨酸到精氨酸的分支途徑,增加L-脯氨酸合成代謝流,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生312.67 mg/L的羥基脯氨酸,但是在發(fā)酵培養(yǎng)基中需要添加脯氨酸和精氨酸,增加了成本[37].

表3 高產(chǎn)羥基脯氨酸的基因工程菌構(gòu)建方法Table 3 Construction methods of high-yield hydroxyproline genetic engineering bacteria

注:1) L-脯氨酸脫氫酶;2) γ-谷氨酰激酶;3) γ-谷氨酰磷酸還原酶;4) 脯氨酸-4-羥化酶;5) 二氫吡咯羧酸還原酶;6) N-乙酰谷氨酸激酶.

表4總結(jié)了羥基脯氨酸三種生產(chǎn)方法.此外,不少研究者以大腸桿菌以外的菌株為羥基脯氨酸的出發(fā)菌株進(jìn)行研究.1995年Serizawa等使用自動(dòng)篩選系統(tǒng)篩選各種微生物,發(fā)現(xiàn)真菌Clonostachyscylindrospora能產(chǎn)生13.8 μg/mL的羥基脯氨酸[40].2014年,研究人員提出將脯氨酸4-羥化酶基因克隆至谷氨酸棒桿菌中生產(chǎn)羥基脯氨酸[32].隨后,Falcioni等將來自指孢囊菌的脯氨酸-4-羥化酶基因引入到能產(chǎn)生脯氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株中,利用高密度細(xì)胞發(fā)酵以葡萄糖為底物,在23 h能生產(chǎn)7.1 g/L的Hyp[41].

表4 羥基脯氨酸生產(chǎn)方法比較Table 4 Comparison of hydroxyproline production methods

4 結(jié) 論

隨著羥基脯氨酸應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展,國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)羥基脯氨酸的需求量逐年增加,對(duì)羥基脯氨酸的純度及其質(zhì)量要求也相應(yīng)的提高.目前羥基脯氨酸的生產(chǎn)方法還存在以下問題:1) 脯氨酸羥基化酶催化L-脯氨酸合成羥基脯氨酸時(shí),酶的催化效率低、反應(yīng)時(shí)間長;2) 全細(xì)胞催化法需要添加L-脯氨酸,增加生產(chǎn)成本,影響后續(xù)的提取分離.因此,可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究:1) 完善脯氨酸羥基酶的分子催化機(jī)制,以更好地利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高羥基化酶對(duì)底物的特異性和催化活性;2) 利用生物信息學(xué)從基因庫中篩選具有催化羥基脯氨酸合成的酶,比較其酶性質(zhì)和合成羥基氨酸的能力,開發(fā)催化效率高、穩(wěn)定性好的酶用于工業(yè)生產(chǎn);3) 利用合成生物學(xué)技術(shù)控制宿主菌的代謝途徑,使更多前體物質(zhì)流向L-脯氨酸合成途徑,從而提高反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率.

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