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(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

(R)-3-奎寧醇,化學(xué)名(3R)-1-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛-3-醇,是合成新型抗膽堿能藥的關(guān)鍵手性中間體,如治療帕金森病的他沙立定(talsaclidine)[1]、治療慢性阻塞性肺疾病的阿地溴銨(aclidinium bromide)[2-3]和瑞伐托酯(revatropate)[4]以及治療尿失禁的索利那辛(solifenacin)[5-6]等.該類藥物的應(yīng)用十分廣泛,既可應(yīng)用于日常的疾病治療,也可用于軍事上對抗化學(xué)武器.因此,(R)-3-奎寧醇的合成研究備受關(guān)注,其制備方法主要有化學(xué)拆分法、化學(xué)不對稱合成、動力學(xué)拆分以及生物不對稱還原法等,其中生物不對稱還原法由于其立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢而備受關(guān)注[7-8].

1 化學(xué)合成法

1.1 化學(xué)拆分法

化學(xué)拆分法是獲得手性化合物的經(jīng)典方法之一.李書彬等[9]在甲醇溶液中利用硼氫化鉀還原法將3-奎寧酮鹽酸鹽還原為外消旋3-奎寧醇,再以V(丙醇)∶V(丙酮)=3∶1的混合溶劑為反應(yīng)介質(zhì),以D-(+)-二苯甲酰酒石酸為拆分劑對外消旋體進行拆分,所得固體經(jīng)重結(jié)晶后得到(R)-3-奎寧醇,e.e.值98%,產(chǎn)率為20.4%.類似的,Ji等[10]利用(L)-酒石酸在乙醇溶液中拆分17.9 g的(+/-)-1-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛基-3-苯甲酸酯,拆分產(chǎn)物經(jīng)15%氫氧化鈉水解得到1.35 g(R)-3-奎寧醇.利用化學(xué)拆分法制備單一構(gòu)型(R)-3-奎寧醇產(chǎn)物需使用手性化學(xué)拆分劑,步驟較多,產(chǎn)率偏低.

1.2 化學(xué)不對稱催化

Tsutsumi等[11]合成了可用于催化3-奎寧酮不對稱加氫制備(R)-3-奎寧醇的化學(xué)催化劑XylSkewphos/PICA-Ruthenium,反應(yīng)過程中底物和催化劑摩爾比為100 000,4.3 kg底物反應(yīng)4 h后,(R)-3-奎寧醇的e.e.值為88%.為提高產(chǎn)物e.e.值,該課題組[12]在異丙醇中采用RuCl2[(S)-binap][(R)-iphan]和t-C4H9OK復(fù)合催化劑體系,將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇,e.e.值大于97%,合成路線為

徐亮等[13]以(S,S)xylskewphosRuBr2QUIMA為手性催化劑,在堿性條件下經(jīng)不對稱還原氫化制得(R)-3-奎寧醇,產(chǎn)物e.e.值大于95%,轉(zhuǎn)化率大于99.5%.化學(xué)不對稱催化制備(R)-3-奎寧醇的反應(yīng)過程中使用少量的金屬手性催化劑即可獲得較高收率,但金屬手性催化劑價格較高,制備過程復(fù)雜,增加了反應(yīng)成本,且部分催化劑不易回收重復(fù)利用,對環(huán)境造成一定的污染.

2 生物合成法

2.1 酶法拆分

Nomoto等[14]利用酶法拆分制備(R)-3-奎寧醇.首先將丁酸酐與外消旋奎寧醇進行反應(yīng)制得奎寧酯,利用質(zhì)量濃度為10 g/L的蜂蜜曲霉蛋白酶水解2 mol質(zhì)量濃度為571 g/L的奎寧酯,反應(yīng)24 h后,萃取得到R型奎寧丁酸酯,然后使用甲醇和碳酸鈉將該酯分解,獲得e.e.值為96%的(R)-3-奎寧醇,收率為42%,合成路線為

Muchmore等[15]將低脂肪酸酐與外消旋奎寧酯反應(yīng)制得一系列奎寧酯,然后利用枯草桿菌蛋白酶催化酯水解,由于該蛋白酶對S構(gòu)型酯的選擇性更強,故優(yōu)先水解S構(gòu)型酯獲得(S)-3-奎寧醇,分離R構(gòu)型酯并進一步水解后得到所需的(R)-3-奎寧醇產(chǎn)物.Primozic等[16]合成了一系列具有保護基團的奎寧酯,以馬血清丁酰膽堿酯酶為生物催化劑,37 ℃下進行酯水解反應(yīng),當(dāng)酯被水解至50%左右時終止反應(yīng),加入適量甲酸銨和10% Pd-C進行相轉(zhuǎn)移催化加氫反應(yīng)制得光學(xué)純(R)-3-奎寧醇,產(chǎn)率低于50%.

利用酶法拆分制備(R)-3-奎寧醇多以外消旋奎寧醇為原料,與適當(dāng)?shù)乃狒磻?yīng)制得相應(yīng)的奎寧酯,再以具有對映選擇性的水解酶為生物催化劑,對奎寧酯進行酶選擇性拆分制得(R)-3-奎寧醇.此方法可獲得高光學(xué)純度的(R)-3-奎寧醇,但拆分產(chǎn)率不超過50%,并且需要先合成得到奎寧酯,反應(yīng)結(jié)束后還需除去剩余酯,步驟多且繁瑣,因此不適合大規(guī)模生產(chǎn).

2.2 生物不對稱還原法

生物不對稱還原法包括酶催化和全細(xì)胞催化,具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點,可用于制備多種手性化合物[17].酶催化的反應(yīng)專一性高、副產(chǎn)物少,但酶的分離純化過程復(fù)雜,反應(yīng)過程中酶的穩(wěn)定性不高、易失活,且需要添加昂貴的輔酶.全細(xì)胞催化是利用微生物細(xì)胞催化潛手性酮不對稱還原得到所需構(gòu)型的手性醇.由于微生物細(xì)胞內(nèi)具有完善的代謝體系和酶系,不需額外添加輔因子,也可省去胞內(nèi)酶的分離純化過程,因而逐漸受到關(guān)注[18-20].

邱健等[21]以3-奎寧酮鹽酸鹽為唯一碳源,從100多份土樣中篩選得到可高選擇性不對稱還原3-奎寧酮鹽酸鹽制備(R)-3-奎寧醇的微生物菌株,命名為RhodotorulamucilaginosaX 15,經(jīng)工藝優(yōu)化后,質(zhì)量濃度為300 g/L的濕菌體催化5 mmol底物轉(zhuǎn)化為(R)-3-奎寧醇的產(chǎn)率為90%,e.e.值為88%,當(dāng)?shù)孜餄舛却笥? mmol/L時,出現(xiàn)明顯的底物抑制現(xiàn)象.Kolet等[22]利用梨形毛霉催化相同底物的不對稱還原,底物質(zhì)量濃度為2.0 g/L,轉(zhuǎn)化12 d后(R)-3-奎寧醇產(chǎn)率為73%,e.e.值為96%.反應(yīng)結(jié)束后以強陽離子交換樹脂-Amberlite IR-120對產(chǎn)物進行分離純化,避免了萃取過程中二氯甲烷等有機試劑的使用,是一種綠色環(huán)保的分離方法.Wang等[23]從土壤中篩選得到Nocardiasp. WY1202和RhodococcuserythropolisWY1406菌株,可將底物3-奎寧酮鹽酸鹽分別轉(zhuǎn)化為(R)-3-奎寧醇和(S)-3-奎寧醇,e.e.值大于99%,合成途徑為

優(yōu)化后Nocardiasp. WY1202在pH 7.0的磷酸緩沖液中將99 mmol/L的3-奎寧酮鹽酸鹽底物還原為(R)-3-奎寧醇,轉(zhuǎn)化率達95.3%.利用篩選的野生菌催化3-奎寧酮鹽酸鹽不對稱還原制備(R)-3-奎寧醇只需一步反應(yīng)即可獲得產(chǎn)物,反應(yīng)條件溫和且產(chǎn)物易分離獲取,但催化轉(zhuǎn)化的底物量偏低.

Uzura等[24]從RhodotorularubraJCM3782中分離出一種NADPH依賴型羰基還原酶RrQR,可將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇,并在大腸桿菌中共表達RrQR和葡萄糖脫氫酶,反應(yīng)21 h后,該重組工程菌可將618 mmol(100 g/L)3-奎寧酮鹽酸鹽還原為(R)-3-奎寧醇,產(chǎn)率達98.6%,e.e.值>99.9%.Isotani等[25-26]從MicrobacteriumluteolumJCM 9174中分離出2 種可將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇的羰基還原酶QNR和bacC,以大腸桿菌為表達載體共表達羰基還原酶和來源于雷弗松氏菌的醇脫氫酶.轉(zhuǎn)化體系中加入異丙醇作為輔助底物用于輔酶再生,并采用連續(xù)補料方式以解除高濃度底物和異丙醇對生物催化劑活性的抑制作用.為進一步提高生物催化劑的重復(fù)使用批次,采用聚乙烯亞胺和戊二醛對重組大腸桿菌細(xì)胞進行固定化.研究發(fā)現(xiàn):采用E.coil/pET28-QNR和E.coil/pKELA質(zhì)量比為1∶1的固定化細(xì)胞作為生物催化劑,在含10%異丙醇、pH 7.0的磷酸鉀緩沖溶液中加入適量固定化細(xì)胞,反應(yīng)48 h可將939 mmol/L(150 g/L)的3-奎寧酮完全轉(zhuǎn)化為(R)-3-奎寧醇產(chǎn)物,制備路線為

劉篤強[27]采用IMAC(Immobilized metal ion affinity chromatography)法實現(xiàn)了3-奎寧酮還原酶QNR和葡萄糖脫氫酶GDH的原位純化和固定化,以該固定化酶為催化劑制備(R)-3-奎寧醇的同時實現(xiàn)了輔酶的再生循環(huán).當(dāng)反應(yīng)體系中底物與固定化酶質(zhì)量之比小于14∶1時,底物可完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,該固定化酶可重復(fù)使用8次.與純酶催化相比,采用固定化酶不僅增加了酶穩(wěn)定性,解決了酶回收和重復(fù)利用等問題,還實現(xiàn)了輔酶的再生和循環(huán).此外,他還分別采用重組細(xì)胞和透性化處理細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化3-奎寧酮制備(R)-3-奎寧醇.重組細(xì)胞可完全轉(zhuǎn)化的最大底物量與濕細(xì)胞的質(zhì)量之比為13∶1,在反應(yīng)體系中加入體積分?jǐn)?shù)為0.4%的甲苯作為透性劑,可將反應(yīng)時間縮短0.5～1 h,且e.e.值高達100%.應(yīng)用透性化技術(shù)可增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,提高胞內(nèi)酶的催化效率.張文霞等[28-29]以不對稱還原3-奎寧酮制備(R)-3-奎寧醇為模型反應(yīng)進行基因挖掘,利用來自放射性土壤桿菌ECU2556的奎寧酮還原酶ArQR催化底物3-奎寧酮還原為(R)-3-奎寧醇.通過鎳柱親和層析對該羰基還原酶進行分離純化,研究發(fā)現(xiàn)在40 ℃,pH 7.0條件下該羰基還原酶的活性最高.此外,還在大腸桿菌中共表達羰基還原酶ArQR和葡萄糖脫氫酶BmGDH,并對葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的串聯(lián)位置、初始底物加量、生物量和反應(yīng)時間等因素進行考察,發(fā)現(xiàn)0.1 g重組工程菌在30 ℃反應(yīng)4.5 h后可將質(zhì)量濃度為242 g/L的底物完全轉(zhuǎn)化為(R)-3-奎寧醇,e.e.值>99%,時空產(chǎn)率達916 g/(L·d),制備路線為

竺偉等[30]以來源于高加索乳桿菌中酮還原酶突變體的重組酮還原酶為催化劑,實現(xiàn)了千克級(R)-3-奎寧醇的制備.反應(yīng)體系中分別加入適量的重組酮還原酶粉、重組葡萄糖脫氫酶粉、葡萄糖、輔酶以及底物,利用TLC法監(jiān)控反應(yīng)進程,當(dāng)轉(zhuǎn)化率高于99%時結(jié)束反應(yīng),最高可將7.5 kg的3-奎寧酮鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為5.84 kg(R)-3-奎寧醇,摩爾收率為94%,純度大于95%,e.e.值大于99%,此反應(yīng)可轉(zhuǎn)化的底物質(zhì)量濃度高達500 g/L,與其他合成方法相比大大提高了制備效率.可用于生物不對稱還原制備(R)-3-奎寧醇的菌種種類較多,除紅酵母屬(Rhodotorulasp.)、諾卡菌屬(Nocardiasp.)和毛霉屬(Mucorsp.)外,戈登氏菌屬(Gordoniasp.)、地霉屬(Geotrichumsp.)、家村氏菌屬(Tsukamurellasp.)和克魯維酵母屬(Kluyveromycessp.)等也可還原3-奎寧酮制備光學(xué)純(R)-3-奎寧醇[31-33].受野生菌受細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)以及胞內(nèi)酶數(shù)量有限等因素限制,致使底物產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的擴散受阻、可轉(zhuǎn)化的底物濃度有限、催化效率偏低.為此,研究人員采用基因挖掘、定點突變等技術(shù)獲得了多種可用于制備(R)-3-奎寧醇的羰基還原酶[34]、重組細(xì)胞[35-38]以及固定化酶或細(xì)胞[39],提高了生物催化劑的催化效率,為(R)-3-奎寧醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持.

3 結(jié) 論

(R)-3-奎寧醇作為抗膽堿能藥的關(guān)鍵手性中間體一直備受關(guān)注,研究人員也從多方面對其制備方法進行了探索.目前采用生物不對稱還原法制備(R)-3-奎寧醇的產(chǎn)量可達千克級,且反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好,與其他制備方法相比更具有工業(yè)化應(yīng)用前景.雖然采用分離純化或基因挖掘等方法獲得的奎寧酮還原酶的催化能力較強,但在轉(zhuǎn)化體系中酶的穩(wěn)定性較低,因此可考慮通過定向進化[40-41]等方法進一步提高酶的穩(wěn)定性,同時利用固定化酶或固定化細(xì)胞以實現(xiàn)生物催化劑的重復(fù)利用,提高催化效率,降低制備過程的生產(chǎn)成本,更好地實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用.

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