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(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310014)

細(xì)菌感染一直威脅著人類的健康,十九世紀(jì)三四十年代,青霉素的發(fā)現(xiàn)及其在臨床治療中的使用,開啟了抗生素治療細(xì)菌感染的新時(shí)代.過去的幾十年里,以青霉素為代表的抗生素治愈了許多細(xì)菌感染病例[1].然而,抗生素在治療細(xì)菌感染時(shí)會(huì)直接殺死細(xì)菌,加重對(duì)病原菌的自然選擇壓力,從而加速抗生素耐藥性或抗生素耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和蔓延,降低其臨床價(jià)值[2-3].隨著抗生素在臨床上的大量使用,細(xì)菌耐藥性問題越來越嚴(yán)重.新抗生素發(fā)現(xiàn)速度的放緩伴隨著多重耐藥菌株在世界范圍內(nèi)迅速增加,迫使人類急需開發(fā)新的、有效的抗菌策略[4].據(jù)報(bào)道[5],許多病原菌,比如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)會(huì)通過群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控毒力因子的表達(dá)和生物被膜的形成[6],使細(xì)菌能逃避抗生素、殺菌素或者宿主免疫系統(tǒng)的清除作用,在宿主體內(nèi)分泌大量的毒素,并最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生.群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)是微生物的一種細(xì)胞密度依賴的信號(hào)傳感系統(tǒng).它可以通過其自身分泌的信號(hào)分子感知細(xì)胞密度的變化,一旦細(xì)胞密度達(dá)到閾值時(shí),會(huì)啟動(dòng)其調(diào)控的基因表達(dá)調(diào)控微生物群體的行為,如生物發(fā)光、生物膜形成、群集運(yùn)動(dòng)、色素產(chǎn)生以及毒素產(chǎn)生等[7-8].破壞病原菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可以顯著降低其毒力因子的表達(dá)水平,而不影響其生長繁殖,理論上不會(huì)導(dǎo)致耐藥性的形成.因此,群體感應(yīng)系統(tǒng)可以作為研究抗菌治療的目標(biāo)系統(tǒng),阻斷或干擾群體感應(yīng)有望成為抗感染治療的有效策略[5,9].

海洋獨(dú)特的生存環(huán)境造就了海洋來源微生物遺傳代謝的多樣性[10],能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物[11].Teasdale等[12]從海洋細(xì)菌Halobacillussalinus中分離到了2個(gè)苯乙酰胺類群體感應(yīng)抑制劑(Quorum sensing inhibitors, QSIs),能夠抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)控制的哈維氏菌(Vibrioharveyi)的生物發(fā)光現(xiàn)象和紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)的群體感應(yīng)系統(tǒng).C.violaceum是一種革蘭氏陰性菌,其紫色桿菌素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控,可以作為群體感應(yīng)抑制活性的篩選模型[13].C.violaceumATCC12472是一種野生型紫色桿菌,它可以自主產(chǎn)生信號(hào)分子調(diào)控紫色桿菌素的產(chǎn)生.而C.violaceumCV026是C.violaceumATCC31532的mini-Tn5的突變體,不能自主產(chǎn)生信號(hào)分子,因此不會(huì)產(chǎn)生紫色桿菌素,只有當(dāng)添加外源信號(hào)分子時(shí),才能啟動(dòng)其群體感應(yīng)系統(tǒng)并產(chǎn)生紫色桿菌素[14].筆者以野生型C.violaceumATCC12472和突變型C.violaceumCV026建立的雙菌株篩選模型,采用雙層平板打孔法從東太平洋深海沉積物中分離具有群體感應(yīng)抑制活性的深海細(xì)菌.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

研究所用深海沉積物樣品由國家海洋局第二海洋研究所提供,采集于東太平洋海域深海海泥層.

1.1.2 菌 株

實(shí)驗(yàn)所用的報(bào)告菌株C.violaceumATCC12472以及C.violaceumCV026由美國羅德島大學(xué)David C.Rowley教授饋贈(zèng).

1.1.3 培養(yǎng)基

1) 海水LB培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂15～20 g/L(固體),海鹽33.3 g/L,pH 7.4.

2) 淡水LB培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂15～20 g/L(固體),pH 7.4.

1.2 方 法

1.2.1 深海細(xì)菌的分離

取深海沉積物5 g,在研缽中加適量無菌海水研磨成細(xì),置于預(yù)先裝有滅菌LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,30 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,獲得深海沉積物富集液.取1 mL富集液用無菌海水10 倍梯度稀釋至10-9～10-1.分別取各稀釋度的沉積物富集液100 μL涂布于LB平板上,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑取生長形態(tài)不同的單菌落劃線分離純化,觀察并排重.將分離得到的細(xì)菌分別進(jìn)行命名和保藏.

1.2.2 深海細(xì)菌的發(fā)酵和粗提物制備

將上述分離純化得到的細(xì)菌分別接種到含有100 mL海水LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,30 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d發(fā)酵至穩(wěn)定期結(jié)束.發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min,棄去菌體,取上清液加入等體積的乙酸乙酯,充分振蕩萃取3次,取上層有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,稱重后以甲醇定溶至50 mg/mL,備用.

1.2.3 深海細(xì)菌乙酸乙酯提取物群體感應(yīng)抑制活性的初篩

C.violaceumATCC12472過夜活化2次,將滅菌LB固體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂)冷卻至40 ℃左右,加入10%活化后的C.violaceumATCC12472種子液,混勻后倒在新鮮LB平板(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂)上形成雙層平板.待平板凝固后,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h.將培養(yǎng)好的平板用打孔器打孔(打孔時(shí)只打到上、下層培養(yǎng)基的接觸面),每個(gè)孔內(nèi)分別加入0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg上述各個(gè)菌株的乙酸乙酯粗提物,并由10 μL甲醇作為陰性對(duì)照,每個(gè)樣品做3組平行樣.30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.重復(fù)篩選實(shí)驗(yàn)3次,排除偶然誤差.若菌液具有群體感應(yīng)抑制活性,則加樣孔周圍應(yīng)有渾濁且不透明的色素抑制圈,直徑越大則活性越強(qiáng).而透明的環(huán)圈是抑菌圈,說明該粗提物樣品會(huì)抑制報(bào)告菌株生長,不是群體感應(yīng)抑制劑.測(cè)量其直徑并記錄.

1.2.4 C.violaceum CV026平板復(fù)篩

C.violaceumCV026過夜活化2次,將滅好菌的LB固體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂)冷卻至40 ℃左右,加入10%活化后的C.violaceumCV026種子液以及終濃度為5 μmoL/L的信號(hào)分子N-hexanoyl-L-homoserinelactone(HHL)和質(zhì)量濃度為20 mg/L的卡那霉素,混勻后倒在新鮮LB平板(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂)上形成雙層平板.待平板凝固后,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h.將培養(yǎng)好的平板用打孔器打孔(打孔時(shí)只打到上、下層培養(yǎng)基的接觸面),每個(gè)孔內(nèi)分別加入0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg上述各個(gè)菌株的乙酸乙酯粗提物,并以10 μL甲醇作為陰性對(duì)照,每個(gè)樣品做3 組平行樣.30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,測(cè)量其直徑并記錄.

2 結(jié) 果

2.1 深海細(xì)菌的分離及粗提物制備

從采集的深海沉積物樣品中總共分離到海洋來源的細(xì)菌50株,部分菌株的平板形態(tài)如圖1.50株細(xì)菌的發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取,減壓旋干,得到對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL的細(xì)菌發(fā)酵粗提物50份.

圖1 部分分離到的深海細(xì)菌Fig.1 Part of deep-sea bacterial isolates

2.2深海細(xì)菌乙酸乙酯提取物群體感應(yīng)抑制活性的初篩

對(duì)上述細(xì)菌發(fā)酵粗提取物進(jìn)行C.violaceumATCC12472平板初篩,結(jié)果如表1所示.篩選的50株菌株中有9株具有不同程度的紫色桿菌素抑制作用,其中有8株抑制圈呈現(xiàn)渾濁、半透明狀,1株抑制圈呈現(xiàn)透明狀.因此,通過C.violaceumATCC12472初篩,初步篩選得到8株具有群體感應(yīng)抑制活性的菌株.

表1深海細(xì)菌乙酸乙酯提取物群體感應(yīng)抑制活性初篩結(jié)果

Table1Preliminaryscreeningresultsofethylacetateextractfromdeep-seabacteriaisolates

菌株群體感應(yīng)抑制活性0.2 mg0.4 mg0.6 mg0.8 mg1.0 mgDC5-++++++++DS1252-Pan29-++++++++++DS1257-+++++++DS1265透明圈透明圈透明圈透明圈透明圈XC2298--++++XC22913++++++++++++XC22915--+++XC22918+++++XC22919+++++++++++

注:-為沒有群體感應(yīng)抑制活性;+為活性較弱;++為活性一般;+++為活性較好.

對(duì)出現(xiàn)紫色桿菌素半透明抑制圈的8株深海細(xì)菌進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到具有群體感應(yīng)抑制活性及穩(wěn)定性較好的3株細(xì)菌,分別為深海細(xì)菌分離株DS1252-Pan29,XC22913,XC22919.從圖2,3可以看出:深海細(xì)菌XC22919群體感應(yīng)抑制活性最好,XC22913和DS1252-Pan29的活性相當(dāng),3株活性菌株紫色桿菌素抑制圈的直徑與加入粗提物的量均呈現(xiàn)較好的濃度依賴性.

0—20 μL甲醇;1—0.2 mg粗提物;2—0.4 mg粗提物;3—0.6 mg粗提物;4—0.8 mg粗提物;5—1.0 mg粗提物 圖2 三株活性深海細(xì)菌提取物對(duì)C.violaceum ATCC12472紫色桿菌素產(chǎn)生的抑制 Fig.2 Inhibition effect on violacein production in C.violaceum ATCC12472 by ethyl acetate extract of three active deep-sea bacteria isolates

圖3 三株活性深海細(xì)菌粗提物對(duì)C.violaceum ATCC12472產(chǎn)生的紫色菌素抑制圈直徑Fig.3 Diameter of violacein inhibition zone by three active deep-sea bacteria isolates extract against C.violaceum ATCC12472

2.3 C.violaceum CV026平板復(fù)篩

選用能自主合成信號(hào)分子的紫色桿菌突變菌株C.violaceumCV026為報(bào)告菌株,加入外源信號(hào)分子HHL,誘導(dǎo)其群體感應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生紫色桿菌素,對(duì)3株初篩活性較好的深海細(xì)菌進(jìn)行紫色桿菌素抑制的復(fù)篩,結(jié)果如圖4,5所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:初篩獲得的3株深海細(xì)菌的乙酸乙酯提取物可以抑制C.violaceumCV026紫色桿菌素的生成,紫色桿菌素抑制圈的直徑隨著深海細(xì)菌粗提物加樣量增加而增大,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性.

0—20 μL甲醇;1—0.2 mg粗提物;2—0.4 mg粗提物;3—0.6 mg粗提物;4—0.8 mg粗提物;5—1.0 mg粗提物 圖4 三株活性深海細(xì)菌提取物對(duì)C.violaceum CV026紫色桿菌素產(chǎn)生的抑制 Fig.4 Inhibition effect on violacein production in C.violaceum CV026 by ethyl acetate extract of three active deep-sea bacteria isolates

圖5 三株活性深海細(xì)菌粗提物對(duì)C.violaceum CV026產(chǎn)生的紫色菌素抑制圈直徑 Fig.5 Diameter of violacein inhibition zone by three active deep-sea bacteria isolates extract against C.violaceum CV026

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)來自東太平洋的深海沉積物樣品采用10倍梯度稀釋涂布法和劃線法,分離純化得到了50株海洋來源的細(xì)菌,接著利用野生型菌株C.violaceumATCC12472和突變型菌株C.violaceumCV026雙菌株模型,經(jīng)初篩和復(fù)篩得到了3株具有群體感應(yīng)抑制活性的深海細(xì)菌.其中利用C.violaceumCV026對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩,既可以利用實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性篩選出更加穩(wěn)定的群體感應(yīng)抑制活性菌株,又可以初步確定活性菌株并非是通過抑制報(bào)告菌株信號(hào)分子的合成或降解信號(hào)分子這兩種方式來干擾或阻斷群體感應(yīng)通路.經(jīng)分析,可能是因?yàn)榛钚跃甑拇渭?jí)代謝產(chǎn)物中產(chǎn)生了能和信號(hào)分子競爭性結(jié)合受體的群體感應(yīng)抑制因子.因此,后續(xù)可以對(duì)這3株深海細(xì)菌進(jìn)行更為深入的研究,從中尋找新穎、高效的小分子群體感應(yīng)抑制劑,為以群體感應(yīng)為靶點(diǎn),通過結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)新型抗菌藥物提供前體化合物.

參考文獻(xiàn)：

[1] LING L L, SCHNEIDER T, PEOPLES A J, et al. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance[J].Nature,2015,520(7547):455-459.

[2] BUSETTI A, SHAW G, MEGAW J, et al. Marine-derived quorum-sensing inhibitory activities enhance the antibacterial efficacy of tobramycin againstPseudomonasaeruginosa[J].Marine drugs,2015,13(1):1-28.

[3] 隋洪楠.香草精油作為抗菌劑的應(yīng)用[J].發(fā)酵科技通訊,2014,43(2):46-49.

[4] BOUCHER H W, TALBOT G H, BRADLEY J S, et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America[J].Clinical infectious diseases,2009,48(1):1-12.

[5] RUTHERFORD S T, BASSLER B L. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control[J].Cold spring harbor perspectives in medicine,2012,2(11):705-709.

[6] 陳小春,嚴(yán)銀春,張甲生,等.太平洋桿菌對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子的抑制作用[J].發(fā)酵科技通訊,2017,46(1):25-29.

[7] JIANG T Y, LI M Y. Quorum sensing inhibitors: a patent review[J].Expert opinion on therapeutic patents,2013,23(7):867-894.

[8] GALLOWAY W R, HODGKINSON J T, BOWDEN S, et al. Applications of small molecule activators and inhibitors of quorum sensing in gram-negative bacteria[J].Trends in microbiology,2012,20(9):449-458.

[9] GRAY B, HALL P, GRESHAM H. Targeting agr-and agr-like quorum sensing systems for development of common therapeutics to treat multiple gram-positive bacterial infections[J].Sensors,2013,13(4):5130-5166.

[10] 喬苗,王海棟.海洋微生物的活性研究進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊,2012,41(3):43-46.

[11] 楊凱琳,程文勝,侯峰,等.海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抑菌活性研究進(jìn)展[J].中國海洋藥物,2013,32(3):71-81.

[12] TEASDALE M E, LIU J, WALLACE J, et al. Secondary metabolites produced by the marine bacteriumHalobacillussalinusthat inhibit quorum sensing-controlled phenotypes in gram-negative bacteria[J].Applied and environmental microbiol,2009,75(3):567-572.

[13] DANIEL M, GILLES G, URS S, et al. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing inChromobacteriumviolaceum[J].BMC microbiology,2004,4(1):1-10.

[14] MOROHOSHI T, KATO M, FUKAMACHI K, et al. N-acylhomoserine lactone regulates violacein production inChromobacteriumviolaceumtype strain ATCC 12472[J].Fems microbiology letters,2008,279(1):124-130.