王 亮,唐文淵,楊 剛,朱 繼,陳 亮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 400016)

葡萄糖是神經(jīng)元代謝的主要能源底物,因其是極性分子,必須通過分布于神經(jīng)元胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3(glucose transporter 3,GLUT-3)介導(dǎo)才能進入神經(jīng)元胞漿內(nèi)代謝產(chǎn)能以維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整。正常情況下,GLUT-3的表達可受其周圍葡萄糖濃度的影響[1]。創(chuàng)傷性腦損傷后(traumatic brain injury,TBI)神經(jīng)元無氧酵解的增加使得其對葡萄糖的需求增加,作為葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的GLUT-3能否相應(yīng)增加就成為TBI后神經(jīng)元耐受因能量耗竭所致?lián)p傷的關(guān)鍵。目前研究表明,腦損傷后高血糖對腦有損害作用[2],胰島素強化治療能顯著改善高血糖患者的預(yù)后[3-4]。本文擬通過檢測正常對照組、TBI組和胰島素治療組傷后GLUT-3表達,神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specifienolase,NSE)陽性染色細胞數(shù)及神經(jīng)癱瘓程度的差異,探討TBI急性期胰島素降糖治療的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 清潔級雄性SD大鼠180只,體質(zhì)量(250.5±12.8)g,采用隨機數(shù)字抽樣法分成正常對照組、TBI組和胰島素治療組,每組又分為受傷前以及傷后 6、12、24、48、72 h共6個時間點,每組每個時間點各10只,5只用于免疫組化標本的采集,5只用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)標本的采集。大鼠均取造模前及處死前10 min尾靜脈血,采用美國Johnson公司One-TouchⅡ型微型血糖儀測定其血糖值。

1.2 主要儀器與試劑 腦外傷頭顱打擊裝置、One-TouchⅡ型微型血糖儀、PCR儀、LEICA光學(xué)顯微鏡、凝膠成像儀、NSE和GLUT-3多克隆抗體、Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、SABC法免疫組化試劑盒、中效低精蛋白鋅胰島素(NPH)。

1.3 動物模型的制作和標本的收集 傷前動物禁食禁水8 h。采用劉媛等[5]的方法制作中型腦外傷模型,打擊沖量50 g/cm術(shù)后以撞擊區(qū)出現(xiàn)明顯硬膜下血腫,動物蘇醒即刻行走向左轉(zhuǎn)圈或偏倒,術(shù)后HE染色撞擊區(qū)出現(xiàn)明顯挫裂傷作為造模成功的標志。傷后動物均采用鼻飼法喂養(yǎng)。胰島素治療組于傷后即刻皮下注射NPH 1.0 u,后每12 h追加1.0 u[6]。正常對照組動物不做致傷處理,但禁食禁水和鼻飼法喂養(yǎng)同TBI組和胰島素治療組。選取傷側(cè)損傷周圍2 mm內(nèi)及健側(cè)對稱部位腦皮層為觀察興趣區(qū)[8],免疫組化標本經(jīng)心灌注4%冷多聚甲醛固定后斷頭取腦,以前后囟連線中點為基線冠狀位切取4 mm厚(基線前后各2 mm)完整腦片按常規(guī)制作成石蠟包埋塊。RT-PCR標本于深度麻醉動物后斷頭取腦,迅速選取損傷周圍2 mm范圍內(nèi)及健側(cè)對稱部位皮層腦組織置于液氮中保存。

表1 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷急性期血糖值變化(mmol/L,n=10)

表1 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷急性期血糖值變化(mmol/L,n=10)

與正常對照組相比較,▲:P＜0.05,△:P＜0.01;與胰島素治療組相比較,★:P＜0.05,☆:P＜0.01;與自身受傷前相比較,○:P＜0.05,○:P＜0.01。

組別 受傷前 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 4.41±0.36 4.45±0.37 4.43±0.40 4.40±0.34 4.52±0.39 4.47±0.35 T BI組 4.53±0.31 4.88±0.34▲★○ 5.23±0.40△☆○ 5.78±0.44△☆○ 5.40±0.34△☆○ 4.94±0.42▲★○胰島素治療組 4.50±0.44 4.56±0.32 4.50±0.35 4.40±0.40 4.52±0.27 4.60±0.36

1.4 相關(guān)指標的測定

1.4.1 興趣區(qū)皮層腦組織GLUT-3 mRNA表達測定 按Trizol試劑說明書提取總RNA,-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肞rimer 5引物設(shè)計軟件設(shè)計GLUT-3和β-actin上下游引物,委托上海生物技術(shù)有限公司合成。GLUT-3上游引物序列5′-AGC GGA GTC GGT TGA AAT-3′,下游引物序列 5′-CCT CAG AGC CCA GAA TAA AG-3′,產(chǎn)物長度 206 bp。β-actin 上游引物列 5′-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA T-3′,下游引物序列 5′-AAA GAA AGG GTG TAA AAC GCA-3′,產(chǎn)物長度483 bp。按試劑盒說明書加樣。RT反應(yīng)條件:30℃10 min,50℃30 min,94℃5 min;PCR反應(yīng)條件:94℃2 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,循環(huán)30次。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離;采用Quanity-one軟件分析 RT-PCR產(chǎn)物帶、本底吸光度和條帶面積,計算出條帶吸光度值A(chǔ),用GLUT-3條帶A值與內(nèi)參β-actin A值比值表示GLUT-3 mRNA的相對表達量。

1.4.2 興趣區(qū)皮層腦組織GLUT-3、NSE免疫組化測定 石蠟包埋塊5 um厚冠狀位切片,按SABC法試劑盒說明書進行GLUT-3(抗體 1∶200倍稀釋)和 NSE(抗體 1∶100倍稀釋)免疫組化染色,顯微鏡下觀察攝像保存。采用impro-plus6.0軟件分析圖像,計算出傷側(cè)及健側(cè)相應(yīng)部位興趣區(qū)皮層腦組織GLUT-3表達的平均光密度值和NSE陽性染色細胞數(shù);各組陰性對照均采用0.01 mmol/L PBS液代替一抗,其余步驟同前。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)傷性腦損傷急性期血糖變化 正常對照組各時間點血糖變化不明顯(P＞0.05);TBI組血糖于傷后 6 h開始升高,一直持續(xù)到傷后72 h;胰島素治療組傷后各時間點血糖升高不明顯(與傷前比較,P＞0.05;與正常對照組相應(yīng)時間點比較,P＞0.05);各組傷前血糖差異不明顯(P＞0.05)。見表1。

2.2 創(chuàng)傷性腦損傷急性期興趣區(qū)皮層GLUT-3 mRNA表達

正常對照組傷側(cè)興趣區(qū)皮層腦組織各時間點GLUT-3表達變化不明顯(P＞0.05);TBI組傷側(cè)興趣區(qū)皮層腦組織GLUT-3表達于傷后 12 h開始增加(0.34±0.03,與正常對照組0.29±0.01相比,P＜0.05),一直持續(xù)到傷后 72 h(0.35±0.03,與正常對照組0.28±0.02相比,P＜0.01),如圖1。胰島素治療組傷后12 h(0.38±0.01,與 TBI組相比,P＜0.05),24 h(0.43±0.02,與TBI組0.40±0.02相比,P＜0.05),48 h(0.46±0.01,與 TBI組 0.43±0.02相比,P＜0.05),72 h(0.40±0.03,與TBI組0.35±0.03相比,P＜0.05)傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3表達明顯高于TBI組,如圖2。各組健側(cè)皮層相應(yīng)部位GLUT-3表達變化不明顯(P＞0.05)。

2.3 創(chuàng)傷性腦損傷急性期興趣區(qū)皮層GLU T-3蛋白表達GLUT-3表達于神經(jīng)元胞膜,免疫組化染色可見其胞膜被染成棕黃色。正常對照組各時間點傷側(cè)興趣區(qū)皮層腦組織GLUT-3表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);TBI組傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3蛋白表達于傷后 12 h開始升高(0.28±0.02,與正常對照組0.23±0.02相比,P＜0.05),48 h達到頂峰(0.34±0.01,與其他各時間點相比,P＜0.01),72 h仍處于較高水平(0.29±0.03,與正常對照組相比,P＜0.05)。胰島素治療組動物傷后 12 h(0.31±0.02,與TBI組相比,P＜0.05),24 h(0.35±0.02,與 TBI組 0.31±0.02相比,P＜0.05),48 h(0.38±0.02,與 TBI組相比,P＜0.01),72 h(0.33±0.01,與TBI組相比,P＜0.05)傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3表達量明顯高于TBI組;各組健側(cè)相應(yīng)部位腦皮層GLUT-3表達變化均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 RT-PCR法測TBI組大鼠傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3 M RNA表達

圖2 RT-PCR法測胰島素治療組大鼠傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3M RNA表達

2.4 創(chuàng)傷性腦損傷急性期興趣區(qū)皮層NSE陽性染色細胞數(shù)

NSE分布于神經(jīng)元胞漿,免疫組化染色可見其胞漿被染成棕黃色。正常對照組傷側(cè)興趣區(qū)皮層腦組織各時間點NSE陽性染色細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);TBI組傷側(cè)興趣區(qū)皮層NSE陽性染色細胞數(shù)于傷后6 h開始降低(36.14±4.91,與正常對照組 45.31±3.76相比,P＜0.05),一直持續(xù)到傷后72 h(9.07±2.41,與正常對照組 46.30±4.11相比,P＜0.01);胰島素治療組動物傷后12 h(34.65±5.24,與TBI組27.52±4.17相比,P＜0.05),24 h(28.97±5.30,與 TBI組18.15±3.52相比,P＜0.01),48 h(24.57±4.41,與 TBI組10.47±3.00相比,P＜0.01),72 h(20.16±3.55,與 TBI組相比,P＜0.05),NSE陽性染色細胞數(shù)明顯多于TBI組;各組健側(cè)皮層NSE陽性染色細胞數(shù)變化均不明顯,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討 論

腦的生理代謝特點決定了其必須依靠細胞內(nèi)持續(xù)的葡萄糖代謝供能才能維持結(jié)構(gòu)和功能的完整。TBI后,效率極低的無氧酵解成為局部主要甚至是惟一的供能方式,使得局部葡萄糖的需求量大幅度增加。葡萄糖是極性分子,其從細胞外進入細胞內(nèi)的過程必須依靠GLUT的介導(dǎo),同時因葡萄糖的攝取是無氧糖酵解的限速步驟,所以腦外傷后局部GLUT的表達一方面可以反映腦攝取葡萄糖的能力[8],另一方面也間接反映了損傷局部腦細胞對葡萄糖的需求程度和局部葡萄糖的代謝率[9]。NSE是糖酵解過程中催化2-磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸的一種關(guān)鍵酶,特異性地存在于神經(jīng)元胞漿[10],腦損傷后,NSE從神經(jīng)元胞漿漏出,通過受損的血腦屏障進入腦脊液和血液,導(dǎo)致受損部位NSE陽性染色細胞數(shù)減少,因此,受損部位神經(jīng)元和血漿中NSE的變化可作為判斷神經(jīng)元損傷的特異性指標之一[11]。近年來,臨床和基礎(chǔ)研究均指出,中重度顱腦損傷后血糖會不同程度的升高,且傷后早期升高水平可作為判斷預(yù)后的獨立危險指標[12-13]。雖然血糖升高從理論上可增加腦組織葡萄糖供應(yīng)量,但胡衛(wèi)星和顧培元[14]研究卻發(fā)現(xiàn)TBI后傷側(cè)葡萄糖代謝量降低,這種降低是否與傷后高血糖導(dǎo)致GLUT表達變化有關(guān),現(xiàn)仍不清楚。故本文通過測定傷后正常對照組、TBI組和胰島素治療組傷后GLUT表達的差異,探討TBI后胰島素降糖治療腦保護作用的可能機制。同時,因神經(jīng)元是永生化細胞,自身糖元儲備少,細胞代謝率高,受損后后果嚴重,且NSE染色后可計算其細胞數(shù),便于評估損傷程度,故本文以其為研究對象,觀察TBI后胰島素降糖對其胞膜GLU T-3表達的影響,從神經(jīng)元角度探討TBI后胰島素降糖治療腦保護作用的可能機制。

本研究資料表明,TBI后6 h就有血糖的升高,48 h到達頂峰,72 h仍明顯高于正常水平;正常對照組各時間點血糖升高不明顯,說明TBI是導(dǎo)致傷后血糖升高的直接原因。關(guān)于TBI導(dǎo)致傷后血糖升高的相關(guān)機制現(xiàn)仍不清楚,目前研究提示其可能與以下幾個方面有關(guān):(1)TBI應(yīng)激興奮交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺糖皮質(zhì)激素系統(tǒng),產(chǎn)生大量的兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素[15],增加了傷后糖原的分解和糖異生作用。(2)TBI應(yīng)激產(chǎn)生的兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素可促使胰腺a細胞大量分泌胰高血糖素[14],促使傷后血糖進一步升高。(3)TBI后胰島素、細胞膜胰島素受體結(jié)合活性下降[16],胰島素作用相對減弱所致的傷后血糖升高。(4)高血糖的形成也可能與TBI所致的傷后胰島素抵抗[17]有關(guān)。

本研究資料亦顯示,TBI后12 h就有傷側(cè)興趣區(qū)皮層GLUT-3表達的上調(diào),且持續(xù)高表達至傷后72 h;正常對照組傷側(cè)皮層各時間點GLUT-3表達變化不明顯,說明TBI是導(dǎo)致傷后GLUT-3表達增加的直接原因。關(guān)于 TBI導(dǎo)致傷后GLUT-3表達上調(diào)的相關(guān)機制尚不明確,推測可能因應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的大量糖皮質(zhì)激素會減弱 GLUT-3轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力[18],TBI后早期GLUT-3表達的增加很有可能是機體應(yīng)對GLUT-3轉(zhuǎn)運能力下調(diào)所做出的一種代償性的反應(yīng)[19]。應(yīng)用胰島素控制大鼠血糖后,傷后12、24、48、72 h GLUT-3表達量明顯增加,提示TBI后高血糖對傷后神經(jīng)元GLU T-3表達的增加有明顯的抑制作用。同時控制 TBI后高血糖在增加GLUT-3表達的同時,神經(jīng)元缺失(表現(xiàn)為NSE陽性染色細胞數(shù)減少)和神經(jīng)癱瘓程度均明顯減輕,說明TBI后高血糖可通過抑制傷后GLU T-3表達的增加,進而加重TBI后神經(jīng)元的損傷。目前,關(guān)于TBI后高血糖抑制GLUT-3表達增加的相關(guān)機制尚不清楚,對其的深入探討也將是作者下一步研究的重點和方向之一。

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