伍 奕，曾 勇，梁松岳

（湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013）

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對于腫瘤的治療模式主要包括手術(shù)、放療、化療三種方式。研究表明，傳統(tǒng)的治療模式能夠治愈部分腫瘤患者，不是由于殺死了全部腫瘤細(xì)胞，而是由于當(dāng)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷明顯降低時(shí)，機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，清除了微小殘留病灶或明顯抑制了殘留腫瘤細(xì)胞的增殖。這說明機(jī)體免疫對腫瘤生長、轉(zhuǎn)化有重要意義[1-3]。吲哚胺2-3雙加氧酶能夠催化色氨酸分子中的吲哚環(huán)氧化裂解，是犬尿酸分解代謝途徑的限速酶，體內(nèi)的吲哚胺2-3雙加氧酶在細(xì)菌和病毒、同種異體器官排斥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)展過程中表達(dá)增加，并可以通過改變微環(huán)境色氨酸及其代謝產(chǎn)物的局部濃度，達(dá)到抑制腫瘤抗原特異性克隆增生的免疫細(xì)胞數(shù)量以及誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的方式，幫助腫瘤細(xì)胞免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊[4-5]。目前，臨床上通過各種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來達(dá)到特異性或非特異性輔助治療腫瘤的治療模式已經(jīng)得到推廣。其中，以特異性較高的免疫藥物針對特異性的靶點(diǎn)開展治療目前還存在一定的技術(shù)上的壁壘。但是，通過應(yīng)用一些免疫調(diào)節(jié)劑并依靠非特異性地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，以達(dá)到治療腫瘤的模式已經(jīng)在臨床廣泛的推廣。臨床觀察發(fā)現(xiàn)晚期腫瘤病人大多伴有免疫功能紊亂，因此在手術(shù)切除腫瘤后使用免疫增強(qiáng)藥物，往往可以到達(dá)調(diào)整機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤的作用，減少腫瘤復(fù)發(fā)的作用[6-7]。其中，香菇多糖作為一種輔助性的免疫調(diào)節(jié)劑在臨床的使用較為廣泛，該藥物的使用對于提高抗腫瘤藥物的治療效果以及緩解患者癥狀方面均顯現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。香菇多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用的機(jī)制目前有著多種理論探討，該機(jī)制是否與機(jī)體內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)間存在某種聯(lián)系，目前還沒有相關(guān)的探討。介于以上背景，筆者設(shè)計(jì)本次觀察，旨在通過觀察香菇多糖對于乳腺癌細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)的影響的初步探討，力求探索香菇多糖輔助性治療腫瘤療效的機(jī)制，為解除機(jī)體對腫瘤的免疫耐受，提高腫瘤的治療效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院住院手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織100例。其中浸潤性導(dǎo)管癌89例、小葉癌7例、其他類型4例。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會制定的第六版分期標(biāo)準(zhǔn)，I期7例，IIA期25例，IIB期39例，IIIA期22例，IIIC期7例。所有病例均得到術(shù)后確切的病理學(xué)診斷。隨機(jī)分為兩組，香菇多糖組：浸潤性導(dǎo)管癌41例，小葉癌3例，其他類型2例，其中，I期3例，IIA期12例，IIB期19例，IIIA期10例，IIIC期3例；空白對照組：浸潤性導(dǎo)管癌48例，小葉癌4例，其他類型2例。其中，I期4例，IIA期13例，IIB期20例，IIIA期12例，IIIC期4例。

1.2 主要試劑

噻唑藍(lán)（MTT）為美國Sigma公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒購自Sigma公司；蛋白提取試劑盒購自Active Motif公司；兔抗人吲哚胺2-3雙加氧酶抗體購自Alexis公司、羊抗兔二抗購自Sigma公司。

1.3 MTT法測定香菇多糖對細(xì)胞增殖的影響

在無菌條件下從剛切除的標(biāo)本上取癌組織1 g，經(jīng)過兩次生理鹽水漂洗，剪碎后放入0.25%胰蛋白酶消化液。細(xì)胞消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，制成單細(xì)胞懸液，分別加入96孔培養(yǎng)板中，5 000個(gè)細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)分香菇多糖組（分別加入香菇多糖10、20、40 uM）、空白對照組（不加藥物，只加細(xì)胞懸液）。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 uL，37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 Ul DMSO振蕩15 min后利用酶標(biāo)一檢測各孔在570 nm波長除的吸光度值，然后計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝[1-(空白對照組A值-香菇多糖組A值)/空白對照組A值]×100%。

1.4 RT-PCR檢測香菇多糖對腫瘤細(xì)胞內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因轉(zhuǎn)錄的影響

取單細(xì)胞懸液，以2×105/孔的濃度接種于6孔板種。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至約70%的覆蓋率時(shí)根據(jù)加香菇多糖情況分成4組：空白對照組、香菇多糖10、20、40 uM組，培養(yǎng)24 h。使用Trizol抽提總RNA，按照RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，從cDNA上擴(kuò)增目的基因。配置2.0%瓊脂糖凝膠，在120 V、25 min條件下對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片的采集。

1.5 Western Blot法檢測香菇多糖對腫瘤細(xì)胞內(nèi)吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)的影響

取單細(xì)胞懸液，以2×105/孔的濃度接種于6孔板種。根據(jù)加香菇多糖情況分成5組：空白對照組、香菇多糖10、20、40 uM組，培養(yǎng)24 h?？偟鞍滋崛?yán)格按照提取試劑盒說明書操作進(jìn)行。蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)膜法。先用5% 脫脂牛奶封閉后，再用TBST洗膜，分別加入各種一抗，4度過夜后，加入二抗室溫反應(yīng)1 h。洗脫后顯影。根據(jù)預(yù)期分子量大小區(qū)域出現(xiàn)的特異性條帶判斷蛋白表達(dá)量的高低。應(yīng)用Bio-Rad公司Quantity-one軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 香菇多糖對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，香菇多糖對腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且該效應(yīng)隨藥物濃度的增加而增大。其中，10、20、40 uM香菇多糖對細(xì)胞的抑制率分別為（6.4±1.19）%，（10.3±1.67）%，（23.5±3.79）%。

2.2 香菇多糖處理后各組細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，香菇多糖處理細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因的表達(dá)，結(jié)果見圖1。藥物處理組細(xì)胞間吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性，其中，40 uM香菇多糖處理組細(xì)胞中目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平最低。藥物處理組與對照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見圖2。

2.3 香菇多糖處理后各組細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)的變化

圖1 香菇多糖處理2-3雙加氧酶基因表達(dá)

圖2 吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)灰度分析

Western blot檢測結(jié)果顯示，香菇多糖作用腫瘤細(xì)胞后，吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)趨勢，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見圖3，圖4。

圖3 香菇多糖處理2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)

表4 吲哚胺2-3雙加氧酶蛋白表達(dá)灰度分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。它的發(fā)病常與遺傳有關(guān)，以及40～60歲之間、絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高。乳腺癌的治療與機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的關(guān)系是一個(gè)極具挑戰(zhàn)的領(lǐng)域。其中，關(guān)于乳腺癌患者自發(fā)性消退現(xiàn)象、許多乳腺癌病人能夠帶瘤生存、部分患者雖然在血液中檢測出腫瘤細(xì)胞，但并未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等等現(xiàn)象，均提示我們該類腫瘤的生長與機(jī)體的免疫系統(tǒng)的防御能力關(guān)系密切。我們有充足的里有相信乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及藥物的治療效果與機(jī)體的免疫狀態(tài)有著直接的因果關(guān)系[8-10]。香菇多糖是一種生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，該藥是繼手術(shù)、放療和化療三大治療手段之后的第四種治療腫瘤的辦法，它通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫防御反應(yīng)或改變機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生機(jī)體或細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效果，發(fā)揮間接的抗腫瘤作用。長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)該藥物具有副作用輕微、對正常細(xì)胞無殺傷作用的特點(diǎn)。

近年來大量的研究表明，吲哚胺2-3雙加氧酶在腫瘤的免疫微環(huán)境以及腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用。多種組織的原代腫瘤細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞株均高表達(dá)吲哚胺2-3雙加氧酶。目前的研究明確，高表達(dá)的吲哚胺2-3雙加氧酶可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞所處的細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸饑餓狀態(tài)，使得機(jī)體的免疫細(xì)胞合成停滯于G1期，導(dǎo)致增殖受到抑制。另外，吲哚胺2-3雙加氧酶可以通過誘導(dǎo)色氨酸代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性作用，發(fā)揮對免疫細(xì)胞的直接溶解作用[11]。

為了明確香菇多糖對于乳腺癌細(xì)胞的治療作用以及該作用對于機(jī)體免疫系統(tǒng)影響，作者設(shè)計(jì)了本次觀察。香菇多糖對腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響實(shí)驗(yàn)表明，它能夠明顯的降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮明確的抗腫瘤作用，并且這種作用的強(qiáng)度與藥物劑量呈現(xiàn)相關(guān)性。介于吲哚胺2-3加氧酶對于腫瘤微環(huán)境中免疫體系的作用，以及香菇多糖作為一種免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的治療角色。作者還觀察了香菇多糖對于腫瘤細(xì)胞吲哚胺2-3雙加氧酶的基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，香菇多糖處理細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞中吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因的表達(dá)。香菇多糖組細(xì)胞間吲哚胺2-3雙加氧酶編碼基因表達(dá)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性。同時(shí)，這種基因水平的抑制作用可以在蛋白水平得到驗(yàn)證。Western blot檢測結(jié)果顯示，香菇多糖作用腫瘤細(xì)胞后，吲哚胺2-3雙加氧酶表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)趨勢。

因此，香菇多糖對于乳腺癌細(xì)胞的抑制增殖作用機(jī)制與抑制吲哚胺2-3雙加氧酶基因以及蛋白水平的表達(dá)有關(guān)，通過該機(jī)制使得機(jī)體的免疫微環(huán)境能夠保持較高的活性狀態(tài)，從而發(fā)揮監(jiān)視、治療腫瘤的功效。

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