趙春霞,王淑秋,叢 嶺

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (nerve growth factor,NGF)是一類最早研究的能夠促進(jìn)神經(jīng)元正常生存、生長(zhǎng)、分化、維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能,加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一。目前 N GF對(duì)癲癇的作用是倍受爭(zhēng)議的。有報(bào)道癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)癲癇動(dòng)物腦內(nèi) N GF升高 ,究竟這種癇性發(fā)作誘導(dǎo) NGF表達(dá)水平迅速而短暫地提高,是作為一種內(nèi)源性的保護(hù),對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù),防止凋亡;還是參與了異常軸突生長(zhǎng)和突觸的重建,從而成為癲癇反復(fù)發(fā)作的病理學(xué)基礎(chǔ),還處在探索之中。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞:海馬神經(jīng)元取源于24h以內(nèi)的新生 Wistar大鼠,購(gòu)自于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RIPA細(xì)胞裂解液:武漢博士德公司。蛋白酶抑制劑 PM SF:碧云天生物技術(shù)公司。AP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠β-actin抗體:北京博奧森生物技術(shù)有限公司。BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒:碧云天生物技術(shù)。兔抗大鼠 N GF多克隆抗體:武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

Wstern-blot觀察 BDNF和 NGF的表達(dá)海馬神經(jīng)元用含5%的特級(jí)胎牛血清和2%的 B-27的 Neurobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在24孔板內(nèi)培養(yǎng)至第9天時(shí) ,隨機(jī)選取培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分組:正常對(duì)照組:將維持培養(yǎng)液全液換成正常細(xì)胞外液處理3h,爬片;模型組:將維持培養(yǎng)液全液換成無鎂細(xì)胞外液處理3h,并且在0min,30min,2h,6h,12h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)上爬片;靈芝孢子粉組:將維持培養(yǎng)液全液換成無鎂細(xì)胞外液的同時(shí),加入0.125g/mL的靈芝孢子粉處理3h,同樣在0min,30min,2h,6h,12h等五個(gè)時(shí)間點(diǎn)上爬片。

1.2.1 蛋白樣品的制備

向收集到的細(xì)胞中加入裂解緩沖液(1mL RIPA+10μL PMSF蛋白酶抑制劑),混勻,裂解5min。再離心12000rpm3～5min,吸取上清測(cè)蛋白含量。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

配制10%分離膠和4%積層膠。電泳:電泳時(shí)間一般4～5h,電壓為 50V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

1.2.3 免疫反應(yīng)

(1)將膜用 TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉 1h。(2)將一抗用 TBST稀釋至適當(dāng)濃度 (在1.5mL離心管中 );室溫下孵育 1～ 2h后,用 TBST在室溫下脫色搖床上洗10min×2,再用 TBS洗一次,10min。(3)同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1～ 2h后,用 TBST在室溫下脫色搖床上洗 10min×2;再用 TBS洗 10min。

1.2.4 顯色

加入適量 BCIP/NBT染色工作液,室溫避光孵育30min或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)24h),直至顯色至預(yù)期深淺。去除 BCIP/NBT染色工作液,用蒸餾水洗滌1～ 2次即可終止顯色反應(yīng)。

1.2.5 結(jié)果判定

使用上海天能凝膠成像處理系統(tǒng),計(jì)算凈光密度值,以Beta-actin為基值,與其進(jìn)行比較的結(jié)果作為其相對(duì)的蛋白表達(dá)量,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常對(duì)照組中只取了相當(dāng)于0min時(shí)的標(biāo)本,結(jié)果可以看見 NGF較弱的表達(dá)(見表1,圖 1)。在模型組中 ,0min時(shí),可見 NGF的表達(dá)強(qiáng)度較正常對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)。在30 min時(shí),NGF的表達(dá)強(qiáng)度都達(dá)到了高峰,從 2 h開始,兩者的表達(dá)強(qiáng)度開始減弱,直至24h時(shí),仍可以觀察到兩者的表達(dá)。在靈芝孢子粉組中,各時(shí)間點(diǎn)的 NGF表達(dá)被完全抑制,但是仍有 NGF的表達(dá),只是強(qiáng)度較模型組中相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯減弱,并且,各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度相近。

圖1 各組細(xì)胞的 NGF和β-actin在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)

表1 不同處理組中 NGF相對(duì)蛋白表達(dá)量 ±s)

表1 不同處理組中 NGF相對(duì)蛋白表達(dá)量 ±s)

注:模型組與靈芝孢子粉組相比較:P＜0.05。

3 討論

3.1 N GF及其受體

NGF在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長(zhǎng)、遞質(zhì)的合成及細(xì)胞的凋亡等階段均起著重要作用,突出的是 NGF對(duì)軸突的生長(zhǎng)方向具有決定性的誘導(dǎo)作用。NGF的受體蛋白有兩種:一種是高親和性 N GF受體,在結(jié)合的動(dòng)力上是慢的,是由原癌基因 trk編碼的一種酪氨酸蛋白激酶受體,稱 TrkA,NGF和TrkA結(jié)合可出現(xiàn)細(xì)胞學(xué)反應(yīng),包括增強(qiáng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)[1];另一種 NGF的受體蛋白是低親和性 N GF受體,簡(jiǎn)稱P75.NGF的生物學(xué)作用是通過受體介導(dǎo)的,推測(cè)其機(jī)制可能為 NGF與 TrkA結(jié)合后產(chǎn)生信號(hào)傳遞,最終提高自由基清除劑活性;穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Na+/K+濃度比、改變 EAAs受體NMDA對(duì) EAAs的反應(yīng)性,緩解 EAAs的毒性;影響鈣通道和鈣排出系統(tǒng)的表達(dá)與活化,使細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度保持穩(wěn)定[2],因而拮抗癲癇發(fā)作所致的細(xì)胞凋亡。

3.2 NGF與癲癇

頻繁而持續(xù)的癲病發(fā)作可引起腦內(nèi)各種酶、神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸等化學(xué)物質(zhì)迅速變化,可導(dǎo)致腦水腫,甚至腦神經(jīng)細(xì)胞死亡,包括神經(jīng)元死亡和凋亡兩種形式;而凋亡由于是遲發(fā)、持續(xù)存在和漸進(jìn)發(fā)展的主動(dòng)性過程,在癲癇神經(jīng)損害中占重要作用。目前主要認(rèn)為癲癇產(chǎn)生過程中興奮性氨基酸增加所致的神經(jīng)毒性作用和神經(jīng)元鈣離子大量?jī)?nèi)流所致鈣超載是神經(jīng)元損傷或死亡的直接原因。張強(qiáng)等人[3]通過采用神經(jīng)節(jié)苷脂(GM I)干預(yù)致癰大鼠發(fā)海馬及額葉發(fā)現(xiàn) NGF陽(yáng)性表達(dá)明顯高于未干預(yù)組,電鏡結(jié)果顯示 GM I干預(yù)后癲癇鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯減輕,并得出 GM I對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用可能通過誘導(dǎo) NGF表達(dá)增多來實(shí)現(xiàn)的結(jié)論。NGF減少神經(jīng)細(xì)胞損傷并參與神經(jīng)元再生的確切機(jī)理可能與拮抗興奮性氨基酸毒性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度;增強(qiáng)抗氧化酶、減輕自由基損傷、抗細(xì)1胞凋亡、增強(qiáng)蛋白激酶 (protein kinase CPKC)活性有關(guān)[4];NGF可通過 NGF高親和力受體(HNGFR一TrkA)和低親和力受體(LN GFR一 p75)介導(dǎo)而提高自由基清除劑的活性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) Na+/K+濃度比、降低興奮性氨基酸毒性、誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白表達(dá)、影響鈣通道和鈣排出系統(tǒng)表達(dá)與活化使細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度保持穩(wěn)定,從而使受損的神經(jīng)細(xì)胞減輕損傷[5,6]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示 ,癲癇模型組 NGF自我保護(hù)性升高,本結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。靈芝孢子粉干預(yù)后,NGF的含量同模型組中相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量相比較都明顯減弱,明顯低于癲癇模型組,說明靈芝孢子粉有明顯抗癲癇作用。靈芝孢子粉能穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的 Na+/K+濃度,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活,維持腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮抗癲癇作用,減輕因癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)元損傷。從而有效抑制 N GF的表達(dá)升高,抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和苔蘚纖維發(fā)芽的形成,從而有效地延緩癲癇的點(diǎn)燃癇后海馬神經(jīng)元的損傷及癇后發(fā)作的強(qiáng)度。靈芝孢子粉的干預(yù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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