臧榮鑫蔡勇

(1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州730030;2西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 甘肅蘭州730030)

卵黃卵磷脂提取純化及純度鑒定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

臧榮鑫1蔡勇2

(1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州730030;2西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 甘肅蘭州730030)

采用正交設(shè)計(jì)分離提取卵黃中的卵磷脂，進(jìn)一步使用硅膠柱層析純化手段，獲得卵磷脂純品，并對(duì)其進(jìn)行薄板層析和紫外分光光度法的純度鑒定，以此作為生物工程、生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)綜合性生物化學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容。

本文將“卵黃卵磷脂提取純化及純度鑒定”作為生物工程、生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)的一個(gè)生物化學(xué)綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，主要內(nèi)容包括:①正交設(shè)計(jì)法分離提取卵黃卵磷脂;②用硅膠柱層析法純化卵磷脂;③分別采用薄板層析法、紫外分光光度法進(jìn)行純度鑒定;④ 對(duì)提取工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)中綜合了萃取技術(shù)、分離技術(shù)、柱層析技術(shù)、薄層層析技術(shù)、紫外分光光度法等內(nèi)容。目的在于通過(guò)本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握生物活性分子分離提取的策略及一般方法，并對(duì)使用的技術(shù)路線(xiàn)或提取工藝進(jìn)行合理性的評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)原理

卵黃中的甘油三酯占全部脂類(lèi)的60%，磷脂約占28%，甾醇脂及其他約占6%。磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，極難溶于丙酮;卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于丙酮;丙酮能夠溶解油脂和游離脂肪酸、甘油三酯等［1］。因此，本實(shí)驗(yàn)在用化學(xué)試劑從蛋黃中提取卵磷脂時(shí)，以乙醇、乙醚為溶劑，丙酮為沉淀劑，經(jīng)過(guò)抽濾、干燥等步驟，最終獲得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂為白色蠟狀物，與空氣接觸后，會(huì)因所含不飽和脂肪酸被氧化而呈黃褐色。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正交設(shè)計(jì)法粗提卵黃卵磷脂

取10g蛋黃放入潔凈的具塞三角瓶中，加入適量有機(jī)溶劑攪拌15min，然后靜置15min，過(guò)濾;濾渣進(jìn)行二次提取，合并二次濾液，低溫減壓濃縮至少量，加入一定量丙酮去除雜質(zhì)，卵磷脂即沉淀出來(lái);過(guò)濾，濾餅用丙酮反復(fù)沖洗數(shù)次，待殘余丙酮揮發(fā)掉，即得到卵磷脂粗品;稱(chēng)其質(zhì)量。

生物活性物質(zhì)的提取受多種因素的影響，如溫度、時(shí)間、溶劑比、料液比等。這種受多因素影響的實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)正交法進(jìn)行;通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)即可取得較好的效果。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交法研究提取溫度、提取時(shí)間、醇醚比、料液比這4個(gè)因素對(duì)提取卵黃卵磷脂的影響，從而獲得卵磷脂的較佳提取條件。

(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):本實(shí)驗(yàn)取4個(gè)因素，即提取溫度、提取時(shí)間、醇醚比、料液比，每個(gè)因素選3個(gè)水平，具體見(jiàn)表1。

表1 提取溫度、提取時(shí)間、醇醚比例、料液比3個(gè)水平的分組情況

按一般方法，如對(duì)4個(gè)因素3個(gè)水平的各種組合都要考慮，共需做34=81次試驗(yàn)，而用L9正交表安排只需做9次試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)安排詳見(jiàn)表2。

表2 根據(jù)正交表L9設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)安排表

(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析:實(shí)驗(yàn)完成后，將9個(gè)數(shù)據(jù)填入表2試驗(yàn)結(jié)果欄，分別計(jì)算出3個(gè)水平試驗(yàn)結(jié)果總和，再分別取平均值(各自被3除)，最后計(jì)算極差(這一列中最好與最壞之差)。從極差的大小可以看出哪個(gè)因素對(duì)提取卵磷脂影響最大，哪個(gè)影響最小，從而找出最佳提取條件。

2.2 卵磷脂的純化

取活化后的柱層析硅膠加適量無(wú)水乙醇攪拌成糊狀，裝柱，用洗脫液(V(乙醇):V(甲醇) =1:1)平衡后，加入10mL 0.224g/mL的卵磷脂粗品，二次平衡后洗脫，洗脫時(shí)流速控制為2.5mL/min。根據(jù)色譜工作站的曲線(xiàn)和定性檢測(cè)結(jié)果，確定目標(biāo)試管，收集洗脫液，濃縮、干燥，得到純化卵磷脂［2-3］。

2.3 薄層層析法鑒定

將硅膠G與0.25%的羧甲基纖維素鈉水溶液按1:3比例調(diào)成糊狀，然后涂布于9cm× 20cm的玻璃板上，厚度0.2cm，自然陰干。使用前置于120℃烘箱中活化1～2h。用微量取樣器取10uL樣品液，點(diǎn)樣，待自然干燥后置于層析缸中，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-水(80:25:3)［4］。待展開(kāi)劑距頂部2cm時(shí)，層析完成，取出硅膠板，吹干，用碘水噴灑顯色。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1表明卵磷脂粗品經(jīng)硅膠G柱層析后得以純化，且純化效果明顯。

2.4 紫外可見(jiàn)吸收光譜鑒定

分別取卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液和樣品的乙醇溶液，在200～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜掃描，對(duì)吸收光譜進(jìn)行比較，鑒定樣品，確定最大吸收峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜(圖2)與各洗脫條件下獲得的卵磷脂樣品的吸收光譜相比，波型基本相同;②標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜與粗提卵磷脂樣品相比有較大差別，但213nm處同樣存在特征吸收;③卵磷脂在200～310nm處有特征吸收，在213nm處為最大吸收峰，此特征可作為紫外分光光度法鑒定卵磷脂的依據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 粗提條件

圖1 卵磷脂薄層層析圖

圖2 卵磷脂紫外吸收光譜

從蛋黃中提取卵磷脂，以卵磷脂的收率為主要控制指標(biāo)，以乙醇和乙醚作為溶劑，丙酮作為沉淀劑粗提卵磷脂，研究探討了提取溫度、提取時(shí)間、醇醚比、料液比等因素對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，最佳條件為:提取溫度25℃;提取時(shí)間60min;醇醚比4:1;料液比1:5。

3.2 純化條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定柱層析法純化卵磷脂最佳洗脫條件為:先用無(wú)水乙醇洗脫，待第一組分被洗脫完成后，改用V(乙醇):V(甲醇)=1:1的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)

薄層層析法及紫外可見(jiàn)吸收光譜鑒定表明:實(shí)驗(yàn)所得樣品純度高，紫外吸收特征與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致;該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)科學(xué)合理，方法切實(shí)可行，能滿(mǎn)足綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)要求。

［1］ 宋宏新.陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，21(4):6

［2］ 趙彬俠，許曉慧，張小里，等.西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，33(2):171

［3］ 張志強(qiáng)，王云山，蘇志國(guó).高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2001，15(1):56

［4］ 李衛(wèi).湖北工學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，15(1):41