郭海萍 鄭雪燕

廣州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)研室（510182）

趨化因子受體CCR5（chemokine receptor 5）為細(xì)胞膜蛋白，它有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族，CC亞族趨化因MIP-1α、MIP-1β以及RANTES是CCR5的主要天然配體[1,2]。CCR5被認(rèn)為是誘導(dǎo)Th1細(xì)胞向炎癥局部遷移的重要因子。目前CCR5已被證實(shí)對活化T細(xì)胞的游走起著非常重要的作用。CCR5的主要生物學(xué)功能是與相應(yīng)的趨化因子結(jié)合來傳遞相應(yīng)信號，使免疫活性細(xì)胞向趨化因子的來源部位募集、移動(dòng)[3]。本研究通過對CCR5模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ）對外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的功能影響進(jìn)行探討，以期發(fā)現(xiàn)相應(yīng)趨化因子受體拮抗藥物的前體分子。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MTS試劑盒（Cell T iter96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay）Promega公司產(chǎn)品。MIP-1α、MIP-1β及RANTES，英國Pepm Tech EC公司產(chǎn)品；RPML1640培養(yǎng)液和胎牛血清，Gibco公司；聚碳酸脂微孔濾膜（Polycarbonate membranes 10μm pore）和48孔標(biāo)準(zhǔn)趨化小室（Standard 48Well Chemotaxis Chamber）Neuro Probe Inc 公司。

1.2 CCR5模擬肽（HDTCSSHFPYSQ）的制備[4]

用噬菌體展示技術(shù)，以CCR5單克隆抗體作為篩選靶標(biāo)，通過篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫與CCR5單抗特異結(jié)合的肽段。經(jīng)鑒定的30個(gè)陽性噬菌體克隆通過DNA測序，獲得CCR5單抗模擬抗原表位的10個(gè)多肽序列。獲得的核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X，與CCR5的一級序列ECL2具有一定的同源，選擇出現(xiàn)頻率最多（9次）的序列短肽（HDTCSSHFPYSQ），交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司采用固相法合成模擬肽，合成肽用高效液相色譜HPLC純化，并經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)，短肽（HDTCSSHFPYSQ）溶解于DMSO中配成100mg/mL，稀釋用pH 7.4的PBS溶液。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離

取健康人新鮮血液（購于廣州市金域體檢中心），用PBS稀釋血液1.5倍；將聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液放入離心管中，沿試管壁徐徐加入稀釋血液至分層液面上1cm處 ，以2000r/min離心20min，離心后，在分層液與血漿交界處用毛細(xì)管吸取細(xì)胞層，獲得單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。37℃、5 %CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FCS）、雙抗青霉素100μg/mL和鏈霉素100μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液中。

1.4 MTS法檢測PBMCs增殖實(shí)驗(yàn)[5]

新鮮分離的PBMCs制成單細(xì)胞懸液，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL，加入PHA 5μg/mL，每孔按0.1mL細(xì)胞懸液的量入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組為3個(gè)重復(fù)孔，空白對照孔不加細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)24h；試驗(yàn)組中每孔各加入0.05mL模擬肽樣品，設(shè)不加入樣品的陰性對照孔，培養(yǎng)48h；每孔各加入0.02mL MTS/PMS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，測定OD490值。抑制率（CI）= （對照組OD490-樣品組OD490）×100 %÷對照組OD490，計(jì)算值等于或超過30 %為抑制效果顯著。

1.5 檢測模擬肽對PBMCs對MIP-1α、RANTES及MIP-1β趨化活性的影響

48孔趨化小室上下室之間用Ⅳ型膠原包被的聚碳酸脂濾膜和乳膠隔墊隔開。下室每室加入29μL無血清RPML1640培養(yǎng)基，調(diào)整收獲的PBMCs懸液，濃度為每毫升1×106 細(xì)胞，加細(xì)胞懸液至上室，每室45μL，3個(gè)重復(fù)樣孔，孵育5h。取出微孔濾膜，刮膜器刮除干凈濾膜上面的細(xì)胞，下層粘附的穿膜細(xì)胞以瑞氏染液固定、染色15min。顯微鏡下隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)視野的總數(shù)表示單核細(xì)胞的趨化能力，平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次。

2 結(jié) 果

2.1 模擬肽對人外周血單核細(xì)胞增殖的影響

采用不同濃度的模擬肽作用于PBMCs，如表1所示，當(dāng)短肽的濃度為20mg/L時(shí)，對PHA誘導(dǎo)的PBMCs增殖表現(xiàn)了明顯的抑制效應(yīng)（P＜0.05），對PBMCs抑制率為30.2%；濃度為100mg/L時(shí)，對PBMCs抑制率達(dá)到了72.1%。

表1 MTS法檢測短肽對PBMCs生長的影響

2.2 模擬肽對人外周血單核細(xì)胞趨化的影響

用模擬肽0.5mg/mL作用于PBMCs 4h，取下游離的聚碳酸脂膜，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)，模擬肽組穿膜細(xì)胞數(shù)為（20±6）個(gè)，與對照組（18±5）相比，穿膜細(xì)胞數(shù)相差無幾，說明短肽對PBMCs沒有趨化作用（P＞0.05），而與RANTES組比較（73±10）穿膜細(xì)胞數(shù)相差明顯（P＜0.05）；而預(yù)先經(jīng)短肽處理2h的PBMCs （短肽+RANTES組） 其穿膜細(xì)胞數(shù)（26±9），則顯著少于RANTES組（P＜0.05），說明短肽能夠抑制PBMCs對RANTES的趨化效應(yīng)。短肽預(yù)處理的短肽+ MIP-1α組和短肽+MIP-1β組分別與MIP-1α、MIP-1β組比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模擬肽不能影響MIP-1α和MIP-1β對外周血單核細(xì)胞的趨化作用（表2）。

表2 模擬肽對人外周血單核細(xì)胞趨化的影響

3 討 論

RANTES和MIP-1α、MIP-1β等CC類趨化因子則主要趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。趨化因子通過和相應(yīng)受體的高親和結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)功能。由于G蛋白耦聯(lián)受體有很高的易操作性，被認(rèn)為是進(jìn)行免疫學(xué)治療阻斷趨化性細(xì)胞因子在許多疾病中所起作用的可靠靶點(diǎn)。本研究對CCR5 模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ）進(jìn)行活性分析，我們采用MTS/PMS比色分析法，測定了活化后的增殖，發(fā)現(xiàn)該模擬肽能抑制PHA對PMBCs的活化增殖作用，20mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到30.2%；且能抑制PBMCs對RANTES的趨化作用，而該模擬肽不能影響MIP-1α和MIP-1β對外周血單核細(xì)胞的趨化作用。推測趨化因子受體CCR5模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ） 可作為CCR5的拮抗劑為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。趨化性細(xì)胞因子受體選擇性拮抗劑的發(fā)展，為進(jìn)一步了解免疫系統(tǒng)的生物學(xué)機(jī)制提供了有力工具，也為我們治療自身免疫性疾病、艾滋病等頑癥提供了一種新的思路。

[1] Atchison REJ,Gosling FS.Multiple extracellular elements ofCCR5 and HIV-1 entry: Dissociation from response to chemokines[J].Science,1996,274(5294): 1924-1926.

[2] Agrawal L,VanHorn AZ,Edward A,et al.Specific inhibition of HIV-1 coreceptor activity by synthetic peptides corresponding to the predicted extracellular loops of CCR5[J].Blood,2004,103(4):1211-1217.

[3] Wolkowicz1 R,Gina CJ.A random peptide library fused to CCR5 for selection of mimetopes expressed on the mammalian cell surface via retroviral vectors[J].J Biol Chem,2005,280(15): 15195-15201.

[4] Smith GP ,Scott JK.Libraries of peptides and proteins displays on filamentous phage[J].Methods Enzymol,1993,217(4):228-257.

[5] Beatrice M,Antonella M. The novel proapoptotic activity of nonnatural enantiomer of Lentiginosine[J].Glycobiology,2010,20(5):500-506.