張紅宇，孟祥晨，姜 博，張偉欽

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

通常將致瀉性大腸埃希氏菌分為五大類(lèi)，腸致病性大腸埃希氏菌（Enteropathogenic E.coli，E PEC）、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（Enteroin-vasive E.coli，EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）以及腸集聚性大腸埃希氏菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）[1]。致瀉性大腸埃希氏菌的致病癥狀主要是引發(fā)不同程度的腹瀉，其感染劑量一般為106～108cfu[2]。

近年來(lái)，各國(guó)由致瀉性大腸埃希氏菌引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。1996年6月到12月，日本爆發(fā)O157∶H7大腸埃希氏菌感染事件，出現(xiàn)了大量食物中毒病人，感染期間全國(guó)共中毒9451人，死亡6人[3]。南昌市1998年8月發(fā)生一起由腸侵襲性大腸埃希氏菌[EIEC O124∶ K72（B17）]引起的食物中毒爆發(fā)，致27人發(fā)生感染性腹瀉病[4]。青島市區(qū)東部某鄉(xiāng)鎮(zhèn)由ETEC引起的井水污染，從2006年9月17日出現(xiàn)首例病人至9月29日出現(xiàn)最后1例發(fā)病病人，共發(fā)現(xiàn)169例患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、發(fā)熱等癥狀并伴有大量水樣腹瀉[5]。在各起致瀉性大腸埃希氏菌感染事件中，最常見(jiàn)的有三種，即EPEC、EIEC、ETEC，針對(duì)基因型的檢測(cè)通常采用eae、ipaH、lt和st基因[6-9]。對(duì)于ETEC，相對(duì)于st、lt是更主要的毒素。本研究即針對(duì)以上3種常見(jiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌的三種致病基因，采用Taqman探針檢測(cè)技術(shù)，建立了可快速檢測(cè)原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌三重實(shí)時(shí)PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與主要試劑

7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀和9700PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；1360型生物潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；TaqDNA聚合酶、dNTPs和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；致瀉性大腸埃希氏菌診斷血清試劑盒（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基

腸致病性大腸埃希氏菌44706、腸侵襲性大腸埃希氏菌44350和單增李斯特菌NICPBP54002（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌CVCC197（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923（黑龍江省應(yīng)用微生物研究所）；熒光假單胞菌As1.1082（中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所）；枯草芽孢桿菌ATCC6051（中國(guó)普通微生物菌種保藏中心）；植物乳桿菌KLDS1.0314和鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028（均由本實(shí)驗(yàn)室保存）。大腸埃希氏菌的繼代培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，分離鑒別培養(yǎng)使用伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，其他參考菌株選擇營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。

1.1.3 原料乳來(lái)源

采自哈爾濱市周邊農(nóng)場(chǎng)及農(nóng)戶(hù)的原料乳。

1.2 引物與探針

依據(jù)文獻(xiàn)[10]針對(duì)eae致病基因設(shè)計(jì)的引物和探針?lè)謩e由上海Invitrogen公司和大連TaKaRa有限公司合成，其探針的發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別為JOE和TAMRA；依據(jù)文獻(xiàn)[11-12]針對(duì)ipaH致病基因設(shè)計(jì)的引物和探針?lè)謩e由上海Invitrogen公司和大連TaKaRa有限公司合成，其探針的發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別為FAM和BHQ1；依據(jù)文獻(xiàn)[13-14]針對(duì)lt致病基因設(shè)計(jì)的引物和探針均由上海Invitrogen公司合成，其探針的發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別為CY5和BHQ2。具體序列見(jiàn)表1。

表1 所用引物和探針Table 1 PCR primers and TaqMan probes used in this study

1.3 方法

1.3.1 原料乳中細(xì)菌基因組DNA的提取

為降低乳中所含物質(zhì)對(duì)DNA提取純度的影響，本文對(duì)Rademaker的方法[15]進(jìn)行了改良：取1 mL待測(cè)原料乳，加入150 μL 18%（W/V）的檸檬酸鈉和 100 μL 4%（W/V）NaOH，10 000 r·min-1離心 10 min，收集菌體細(xì)胞，加入1 mL PBS緩沖液吹打沉淀，于12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，再加入1 mL 1×TE 吹打沉淀，于 12 000 r·min-1離心 2 min，棄上清，將收集到的菌體用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3.2 Taqman三重實(shí)時(shí)PCR方法的反應(yīng)條件

本試驗(yàn)選用50 μL反應(yīng)體系，具體組分為：3 U的 Taq DNA 聚合酶，10×PCR緩沖液（無(wú) Mg2+）5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）5 μL，EPEC、EIEC 和 ETEC 模板各 2 μL，Rox參比染料（1×）1 μL，eae探針（10 μmol·L-1）2.0 μL，ipaH探針（10 μmol·L-1）1.8 μL，lt探針（10 μmol·L-1）1.2 μL， eae 上下游引物（10 μmol·L-1）各 2 μL，ipaH 上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL， lt上下游引物（10 μmol·L-1）各 3 μL。

所確定的三重Taqman熒光PCR體系的循環(huán)參數(shù)為：

有下劃線(xiàn)的步驟表示在此階段末端收集熒光信號(hào)。

1.3.3 人工污染致瀉性大腸埃希氏菌乳樣的制備

將EPEC或EIEC或ETEC培養(yǎng)液按照1%接種量接種于超高溫滅菌乳中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h，即為人工污染乳樣。

1.3.4 特異性檢測(cè)

以EPEC 44706、EIEC 44350和ETEC CVCC197的DNA為陽(yáng)性模板，以大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028、單增李斯特菌NICPBP54002、植物乳桿菌KLDS1.0314、熒光假單胞菌As1.1082和枯草芽孢桿菌ATCC6051的DNA為陰性模板，建立11個(gè)三重PCR反應(yīng)體系，第1個(gè)反應(yīng)管中加入EPEC、EIEC和ETEC的DNA，第2～4個(gè)反應(yīng)管中分別加入EPEC、EIEC和ETEC兩兩組合的DNA，第5～11個(gè)反應(yīng)管中分別加入7種陰性對(duì)照的DNA，同時(shí)以去離子水做空白對(duì)照，進(jìn)行同一批次的三重實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各個(gè)反應(yīng)中JOE、FAM和CY5熒光基團(tuán)有無(wú)指數(shù)期增長(zhǎng)變化，以此判定本試驗(yàn)所采用引物及探針的特異性是否良好。

1.3.5 靈敏度檢測(cè)

將已知 EPEC 含量（約為 4.30×107cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調(diào)節(jié)乳樣中EPEC 濃 度 約 為 4.30 ×106、 4.30 ×105、 4.30 ×104、4.30×103、4.30×102、2.15×102、1.08×102、4.30×101和 4.30×102cfu·mL-1；將已知 EIEC 含量（約為2.81×108cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調(diào)節(jié)乳樣中 EIEC濃度約為2.81×107、2.81×106、2.81×105、2.81×104、2.81×103、2.81×102、1.41×102、2.81×101cfu·mL-1；同樣，將已知ETEC 含量（約為 1.08×108cfu·mL-1）的乳樣加入到一系列滅菌原料乳中，分別調(diào)節(jié)乳樣中ETEC濃度約 為 1.08 ×107、 1.08 ×106、 1.08 ×105、 1.08 ×104、1.08×103、5.40×102、2.70×102、1.08×102、1.08×101cfu·mL-1。再按照1.3.1方法分別提取上述乳樣中細(xì)菌基因組DNA，提取的DNA分別用Taqman三重實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)的形態(tài)及Ct值確定該方法的檢測(cè)限。

同時(shí)分別將菌含量均約為1 cfu·mL-1的EPEC、EIEC和ETEC乳樣置于37℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、1、2和3 h后各取1 mL，按照1.3.1方法提取細(xì)菌基因組DNA，所提DNA用于Taqman熒光PCR擴(kuò)增，以確定當(dāng)檢測(cè)限為1 cfu·mL-1時(shí)的增菌時(shí)間。

1.3.6 重復(fù)性檢測(cè)

將 37 ℃振蕩（200 r·min-1）培養(yǎng) 16 h后，已知 EPEC濃度約為 4.30×107cfu·mL-1，EIEC濃度約為 2.81×108cfu·mL-1，ETEC 濃度約為 1.08×108cfu·mL-1的3種乳樣，分別進(jìn)行10和100倍稀釋?zhuān)凑?.3.1方法分別提取乳樣的基因組DNA，每種菌株各得到3組濃度不同的DNA模板，按照已經(jīng)確定的1.3.2方法對(duì)3組不同濃度的DNA進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)。在批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)中，DNA模板選取以上3種濃度；在批間重復(fù)性檢測(cè)中，DNA模板只選取一種濃度（所對(duì)應(yīng)的ETEC的濃度約為1.08×108cfu·mL-1，EIEC 的濃度約為 2.81×107cfu·mL-1，EPEC濃度約為4.30×105cfu·mL-1），分5批次重復(fù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。以上每一種反應(yīng)體系均同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，最后對(duì)獲得的Ct值進(jìn)行匯總，通過(guò)計(jì)算樣品不同Ct值的變異系數(shù)來(lái)評(píng)定該方法的重復(fù)性。

1.3.7 原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的檢測(cè)

采集哈爾濱市內(nèi)及周邊地區(qū)小型奶牛場(chǎng)或奶牛養(yǎng)殖戶(hù)共38份原料乳樣品，于37℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)2 h后，按照1.3.1方法提取DNA，所提取的DNA按照1.3.2方法進(jìn)行三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。同時(shí)采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.6-2003文獻(xiàn)[6]。比較國(guó)標(biāo)方法和本研究所建立方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測(cè)

三種原料乳中常見(jiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌和7種陰性對(duì)照菌株經(jīng)三重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)后結(jié)果見(jiàn)圖1。每個(gè)反應(yīng)管中均含JOE、FAM和CY5（分別代表eaeP、ipaHP和ltP探針的熒光信號(hào)）3種熒光探針，管與管之間的區(qū)別在于DNA種類(lèi)的不同。管1中含有三種菌的DNA，對(duì)管1檢測(cè)到3條熒光曲線(xiàn)，一條為JOE熒光形成，一條為FAM熒光形成，另一條為CY5熒光形成。管2中有EPEC和EIEC兩種菌的DNA，故只有兩條熒光曲線(xiàn)。管3中只有EIEC和ETEC兩種菌的DNA，故只有FAM和CY5的熒光曲線(xiàn)。管4中只有EPEC和ETEC兩種菌的DNA，故只有JOE和CY5的熒光曲線(xiàn)。管5～11分別為其他菌的DNA，均未檢測(cè)到熒光增加信號(hào)，表現(xiàn)為陰性。由此看出，三重?zé)晒釶CR反應(yīng)時(shí)3種探針的熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，與3種探針兩兩組合反應(yīng)時(shí)并無(wú)明顯區(qū)別，也說(shuō)明引物和探針與其他致病菌無(wú)交叉反應(yīng)，三重?zé)晒釶CR具有良好的特異性。

圖1 以目的菌株DNA與陰性對(duì)照菌株DNA為模板的Taqman三重實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增Fig.1 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with DNA of target strains and negative control strains

2.2 靈敏度檢測(cè)

從圖2可以看出，當(dāng)EIEC含量在2.81×108～1.41×102cfu·mL-1時(shí)，均能檢測(cè)到熒光信號(hào)和Ct值，但在EIEC含量為1.41×102cfu·mL-1時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)已經(jīng)不明顯，且Ct值為32.67，明顯大于30，因此，Taqman三重實(shí)時(shí)PCR對(duì)EIEC的檢出限可達(dá)到2.81×102cfu·mL-1，同理可得出，Taqman 三重實(shí)時(shí)PCR對(duì)EPEC的檢出限可達(dá)到2.15×102cfu·mL-1（見(jiàn)圖3），對(duì)ETEC的檢出限可達(dá)到5.40×102cfu·mL-1（見(jiàn)圖 4）。

圖2 Taqman三重實(shí)時(shí)PCR對(duì)不同濃度的EIEC的擴(kuò)增Fig.2 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EIEC of different concentrations

圖3 Taqman三重實(shí)時(shí)PCR對(duì)不同濃度的EPEC的擴(kuò)增Fig.3 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing EPEC of different concentrations

此外，由于通常致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的數(shù)量較小，甚至達(dá)到每毫升個(gè)位的數(shù)量，所以需要對(duì)采集的原料乳進(jìn)行一定時(shí)間的前增菌處理，以提高該方法于實(shí)際應(yīng)用中的可行性，并且可以通過(guò)縮短增菌時(shí)間的方式，來(lái)達(dá)到快速檢測(cè)的目的。將3種原始菌體濃度均為1 cfu·mL-1的奶樣于搖床培養(yǎng)2 h后提取細(xì)菌基因組DNA，然后進(jìn)行Taqman三重實(shí)時(shí)PCR，即可出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)。說(shuō)明該方法在2 h增菌處理后檢測(cè)限可達(dá)到 1 CFU·mL-1。

2.3 重復(fù)性檢測(cè)

表2是3種不同濃度的模板批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的Ct值結(jié)果。從表2可看出，雖然3組中所用DNA濃度不同，但各自擴(kuò)增Ct值的SD和CV值都較低，CV值均小于5%，說(shuō)明用不同濃度的DNA所做的Taqman三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增所得結(jié)果穩(wěn)定可靠。在同一菌體范圍內(nèi)，隨著菌體濃度的減小，SD和CV值有上升趨勢(shì)，即穩(wěn)定性降低，所以在應(yīng)用此方法時(shí)要盡量提高菌液濃度以減小誤差提高穩(wěn)定性。

圖4 Taqman三重實(shí)時(shí)PCR對(duì)不同濃度的ETEC的擴(kuò)增Fig.4 Taqman triplex real-time PCR amplication curves with artificial polluted milk containing ETEC of different concentrations

表2 所建立的Taqman三重實(shí)時(shí)PCR法的批內(nèi)重復(fù)性檢驗(yàn)的Ct值

表3為批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，該表中顯示的CV值均在合理的范圍內(nèi)（CV＜5%）。雖然EIEC的濃度比ETEC低，但Ct值是最小的，說(shuō)明EIEC的擴(kuò)增最為理想。

批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，該試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

2.4 市售原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的檢測(cè)

分別采用國(guó)標(biāo)GB/T 4789.6-2003的方法和Taqman三重實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)所采集的38份原料乳樣品，兩種方法所獲得結(jié)果高度一致：均共檢出致瀉性大腸埃希氏菌10株，其中EPEC 4株，ETEC 4株，EIEC 2株。說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的Taqman三重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌的方法準(zhǔn)確可行，且Taqman三重實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)樣品只需6 h即可完成全部過(guò)程，操作簡(jiǎn)便，而國(guó)標(biāo)GB/T 4789.6-2003方法檢測(cè)樣品需耗時(shí)4～5 d。

表3 所建立的Taqman三重實(shí)時(shí)PCR法的批間重復(fù)性檢驗(yàn)的Ct值Table 3 Threshold cycle value of inter-assay of reproducibility test of Taqman triplex real-time PCR

3 討論

針對(duì)致瀉性大腸埃希氏菌的常規(guī)分離培養(yǎng)方法主要是指GB/T 4789.6-2003中所用方法，該方法主要分為增菌、分離、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、腸毒素試驗(yàn)五個(gè)部分，前后耗時(shí)約4 d，該方法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可檢測(cè)出致瀉性大腸埃希氏菌的血清型，缺點(diǎn)是所耗時(shí)間較長(zhǎng)，且操作繁瑣，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法表明致病菌所攜帶的致病基因[17]。免疫學(xué)檢測(cè)方法存在與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng)，從而會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，而如果待測(cè)抗原被樣品中一些物質(zhì)或其他優(yōu)勢(shì)菌群所掩蔽，又會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。大腸桿菌的抗原很復(fù)雜，各種腸道細(xì)菌之間可能會(huì)發(fā)生基因的水平轉(zhuǎn)移，而且還存在抗原表達(dá)不完全和抗原間抑制抗原-抗體凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，從而影響了免疫學(xué)方法的特異性和敏感性。PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前最先進(jìn)、最廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)。而加染料或探針的熒光實(shí)時(shí)PCR既保持了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽(yáng)性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控，且不需要普通PCR的后處理，極大地減少了污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)也避免了染色劑對(duì)人體的毒害作用[9,13]。致瀉性大腸埃希氏菌包括很多致病基因，若要實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)中將致病基因全部檢出的目的，就需要應(yīng)用多重PCR技術(shù)。根據(jù)所用熒光物質(zhì)的不同，熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)主要分為SYBR GreenⅠ染料法、Taqman探針?lè)ê头肿有艠?biāo)法。本文所研究的Taqman多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)即可在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出3種病原微生物，有效地解決了單基因PCR體系1次只可檢測(cè)1個(gè)基因型的低效缺點(diǎn)，具有高效、快捷、靈敏的特點(diǎn)。

本方法對(duì)3種致瀉性大腸埃希氏菌的檢出限均可達(dá)到102cfu·mL-1，但通常致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的數(shù)量較小，能達(dá)到每毫升幾十個(gè)甚至幾個(gè)的數(shù)量，由于如果直接從所采集的樣品中提取DNA后，進(jìn)行Taqman三重實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，勢(shì)必會(huì)造成假陰性的結(jié)果，所以需要對(duì)原料乳進(jìn)行一定的增菌處理，以提高該方法于實(shí)際應(yīng)用中的可行性。本研究在2 h增菌處理后可達(dá)到1 cfu·mL-1，符合致瀉性大腸埃希氏菌在原料乳中的實(shí)際存在狀況，具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

張偉欽對(duì)EPEC和EIEC原始菌體濃度分別為為8.8和6.7 cfu·mL-1的兩份乳樣進(jìn)行2 h的增菌處理后，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)PCR，兩種菌均可出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，但Ct值要略高于本試驗(yàn)[7]。Bottero等對(duì)模擬乳樣過(guò)夜增菌后，在多重PCR中加入六對(duì)引物檢測(cè)致瀉性大腸埃希氏菌的基因型，對(duì)于ETEC的st和lt的檢測(cè)限分別為 5×104和 5×106cfu·mL-1[8]，由于常規(guī)PCR較熒光PCR靈敏度不夠，同時(shí)多對(duì)引物間的競(jìng)爭(zhēng)作用提高體系的復(fù)雜性，從而降低擴(kuò)增效果，使得檢測(cè)限較高，但可看出若選擇st基因作為ETEC的目的基因，于相同條件下可相對(duì)提高檢測(cè)限。

4 結(jié)論

本研究采用已建立了反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)的三重實(shí)時(shí)PCR方法可快速檢測(cè)原料乳中致瀉性大腸埃希氏菌，達(dá)到了一次PCR反應(yīng)即可檢測(cè)3種病原菌的目的。試驗(yàn)證實(shí)此方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性良好，CV值均小于5%，對(duì)EIEC的檢出限可達(dá)到2.81×102cfu·mL-1，對(duì) EPEC 的檢出限可達(dá)到2.15×102cfu·mL-1，對(duì) ETEC的檢出限可達(dá)到 5.40×102cfu·mL-1，同時(shí)當(dāng)致瀉性大腸埃希氏菌菌體濃度達(dá)到1 cfu·mL-1時(shí)，只需富集培養(yǎng)2 h，即可檢出陽(yáng)性結(jié)果，大大提高了靈敏度，完成全部檢測(cè)過(guò)程只需大約6 h，簡(jiǎn)便快捷，可實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程。

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