董江濤，李 燕，徐慧強，蔣橙華

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

葎草[Humulus scandens（Lour.）Merr.]為?？迫劜輰俨荼局参颷1]。野生于田間路邊，又名烏爪龍、拉拉藤、過膚龍等，廣泛分布于我國大部分地區(qū)[2]。藥理研究證明，其具有抗茵、抗炎、止瀉抑菌、降壓、鎮(zhèn)痛等作用[3]。已報道的從葎草全草中分離出的主成分為黃酮類化合物[4]。但是，葎草黃酮的提取鮮有報道，并且提取得率差別很大，因此本研究期望通過響應曲面法的優(yōu)化，在獲得較高的提取得率同時，也測定出葎草中黃酮的含量。

微波輔助提取技術是利用微波場的生物效應、熱效應及“擾動”效應來加速物質的擴散溶解，有效地提高化合物提取的得率與含量。微波輔助提取技術用于黃酮類化合物的提取時具有選擇性高、提取時間短、溶劑用量少、后處理方便耗能低、對環(huán)境安全無害等優(yōu)點[5]。試驗以黃酮的提取得率為指標，對微波功率、提取時間和液料比的單一和交互作用等進行研究，應用響應面法對微波提取葎草黃酮的條件進行優(yōu)化，以期得到微波輔助提取的最佳工藝參數(shù)，為葎草黃酮的提取及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葎草：11月中旬采自安徽亳州，自然晾干；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均為分析純。

1.2 儀器與設備

WFZ-UV2000紫外可見分光光度計，（尤尼柯儀器有限公司）；XH-MC-1微波催化合成萃取儀（北京祥鵠高科技發(fā)展有限公司）；sartorius BS210S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能粉碎機（廣東佛山市方勝電器有限公司）；高速冷凍離心機（H2050R-1長沙湘儀離心機儀器有限公司）；微量移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 制備提取液 葎草60℃恒溫烘干，粉碎，過20目篩，準確稱取塊狀碎片1.0 g，加入60%乙醇，微波輔助提取，提取液經(jīng)抽濾、離心后于50 mL容量瓶中以60%乙醇定容，搖勻待用。

1.3.2 蘆丁標準曲線制作 準確稱取0.010 0 g蘆丁標準品以60%的乙醇溶解后，定容到50 mL容量瓶中得到0.200 mg/mL的蘆丁標準液。分別準確量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 此標準液于8個25 mL容量瓶中，依次分別加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；1.0mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置 6 min；10.0 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15 min。在510 nm處測定吸光度（A），以濃度（mg/mL）為橫坐標，A為縱坐標作標準曲線[10]。

1.3.3 總黃酮含量測定與計算 黃酮含量測定采用硝酸鋁絡合分光光度法，其原理是黃酮類化合物經(jīng)亞硝酸鈉還原后，與硝酸鋁絡合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物，此化合物在510 nm處有最大吸收，然后以蘆丁作標準，通過測定吸光度計算含量。

準確移取1.0 mL的樣品液于50 mL容量瓶中，其余操作同1.3.2標準曲線制作。根據(jù)標準曲線換算，按以下公式計算總黃酮得率。

1.3.4 單因素試驗設計 分別考察了微波功率、液料比、提取時間、乙醇濃度等4個因素，在各自5個水平上的提取得率，具體參數(shù)見表1。

表1 單因素試驗考察因素及水平

（1）微波功率對提取得率的影響。在液料比20∶1、提取時間20 min、乙醇濃度60%的條件下，考察微波功率對葎草黃酮提取得率的影響。

（2）提取時間對提取得率的影響。在液料比20∶1、乙醇濃度60%、微波功率為420 W的條件下，考察提取時間對葎草黃酮提取得率的影響。

（3）液料比對提取得率的影響。在提取時間20 min、乙醇濃度60%、微波功率為420 W條件下，考察液料比對葎草黃酮提取得率的影響。

（4）乙醇濃度對提取得率的影響。在液料比20∶1、提取時間20 min、微波功率為420 W條件下，考察乙醇濃度對葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.5 響應曲面設計 應用Box-Behnken設計方案對單因素試驗結果做響應曲面研究，建立葎草黃酮提取得率的二次多項式數(shù)學模型。三個自變量微波功率、提取時間和液料比分別以X1、X2和X3代表，以＋1、0、－1分別代表各自的不同水平，每個變量按方程進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。試驗模型可用二次多項式表達為：

Y 為葎草黃酮提取得率的響應值，Ai、Aii、Aij為模型的相關系數(shù)，Xi、Xj（i≠j）為自變量編碼值，響應面法設計的編碼因素及水平見表2。

表2 響應面法分析因素及水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線

從圖1中可以看出，蘆丁標準曲線回歸方程為：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中 C 為黃酮濃度（mg/mL），A為吸光度，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 微波功率對提取得率的影響 由圖2中可知：在較低的微波功率條件下，黃酮的提取率隨微波功率的增強而顯著增加，但微波功率達到420 W后，黃酮提取率會降低，是因為過高的微波功率下溫度升高明顯，使得蛋白質變性，阻礙了黃酮的溶出。此外乙醇會沸騰，沸騰的乙醇蒸汽冷凝回流的時間過程間接地縮小了液料比，使得乙醇與葎草沒有充分接觸，黃酮沒能完全溶出。

圖1 蘆丁標準曲線圖

圖2 微波功率對提取得率的影響

2.2.2 提取時間對提取得率的影響 在10～25 min的時間內，隨著提取時間的延長，總黃酮的得率不斷升高，浸提時間在25 min時，黃酮提取得率達到最大值，25 min后開始下降。原因是浸提起始時，葎草與溶劑接觸充分，黃酮能夠充分溶解，但隨著時間的延長，微波會促進黃酮的氧化，因此，葎草黃酮較佳的提取時間為25 min。

2.2.3 液料比對提取得率的影響 從圖4可以看出，當液料比從10∶1擴大至20∶1時，總黃酮的得率增加趨勢非常明顯，在20∶1時達到最大值，之后開始減小，這是由于液料比擴大可以增加物料與溶劑的接觸面積，使得黃酮類物質更充分的溶解出來，過多的溶液會吸收微波從而降低了微波對黃酮溶解的促進作用。另外液料比過大也會溶解出過多的雜質，不僅耗損了大量的試劑，也給后來的純化工作帶來困難，所以確定最佳液料比為20∶1。

圖3 提取時間對黃酮提取得率的影響

圖4 液料比對黃酮提取得率的影響

2.2.4 乙醇濃度對提取得率的影響 由圖5可知隨著乙醇濃度的升高，總黃酮得率隨著升高，當乙醇濃度達到60%時，總黃酮得率達到最大值。隨著濃度進一步提高，總黃酮含量逐漸降低。是因為乙醇濃度過高時，一些親脂性強的成分等溶出增多，并與總黃酮競爭地與乙醇-水分子結合，干擾黃酮的溶出。

圖5 乙醇濃度對黃酮提取得率的影響

2.3 響應曲面優(yōu)化試驗

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗 響應面設計中，以微波功率、提取時間和液料比為參數(shù)，葎草黃酮的提取得率為響應值，進行了3因素3水平響應面分析試驗。試驗結果見表3。

由表3可知，試驗值與預測值很接近，模型適應性高。利用Design Expert 7.0.0軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到葎草黃酮提取得率（Y）對編碼自變量：微波功率（X1）、提取時間（X2）和液料比（X3）之間的二次多項回歸方程：

表3 響應曲面試驗結果

Y=1.82+0.068 X1+0.040 X2+0.043 X3－0.046 X1X2－0.066 X1X3－0.033 X2X3－0.17 X12－0.078 X22－0.085 X32。

從表4黃酮得率回歸模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=21.9＞F0.01（9.4）=14.8，p=0.000 3，表明模型極其顯著。黃酮得率F失擬=1.04＜F0.05（9.3）=8.81，失擬項p=0.47＞0.05，表明失擬不顯著。模型一次項微波功率（X1）（p=0.001 6）、提取時間（X2）（p=0.027 7）、液料比（X3）（p=0.016 2）顯著；二次項均顯著；交互項X1X2（p=0.047 6）、X1X3（p=0.011 0）；X2X3（p=0.130 4）不顯著。

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢查

Design Expert軟件中Box-Behnken法計算葎草黃酮得率回歸模型的調整確定系數(shù)（AdjR-squared）RAdj2=0.9217，即該模型能解釋92.17%響應值的變化，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，說明響應曲面法優(yōu)化葎草總黃酮的提取條件是可行的。

2.3.2 響應曲面分析 利用Design Expert 7.0.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及其響應面見圖6～8。根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應曲面的形狀可以評價試驗因素之間的交互作用強度，以及確定各因素的最佳水平范圍。

由圖6可知：當液料比為20∶1，提取時間不變的條件下，微波功率在400W～420W范圍內增大時，葎草黃酮提取得率急劇增加，并在420 W附近達到極大值而后緩慢降低，與單因素試驗結果吻合。

圖6 提取時間、微波功率的等高線和響應曲面圖

由圖7可知：提取時間不變的條件下，固定微波功率，曲線呈現(xiàn)陡峭增加后平滑遞減的規(guī)律，說明液料比在較低的水平下對葎草黃酮提取得率影響大于較高水平下的影響。

圖7 微波功率、液料比的等高線和響應曲面圖

由圖8可知：微波功率固定的條件下，液料比不變的情況下，葎草黃酮提取得率受提取時間的影響顯著，表現(xiàn)為先升高后降低的較陡曲線。

圖8 提取時間、液料比的等高線和響應曲面圖

等高線的形狀可反映出因素間交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用顯著，而圓形則相反。響應曲面坡度的陡峭程度表現(xiàn)響應值對因素變化的敏感性。圖6、圖7可以看出等高線呈橢圓，說明提取時間和微波功率、微波功率和液料比之間交互影響顯著，響應面陡峭說明提取得率對提取時間、微波功率和液料比的變化敏感[6-9]。

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即3個主要因素的最佳水平值，轉換后得到提取的最佳條件為：微波功率422.81 W、提取時間25.89 min、液料比20.82∶1，此時葎草總黃酮的得率達1.83%。

2.4 模型驗證

對試驗進行驗證，選擇的條件為微波功率420 W.、提取時間為 26 min、液料比 21∶1，黃酮的得率分別為 1.68%、1.74%、1.72%、1.69%、1.75%，平均為1.73%，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測量值穩(wěn)定說明每次測定的黃酮含量穩(wěn)定，證明該結果是合理可靠的。

3 結論

試驗通過響應曲面法的優(yōu)化，得到了影響微波輔助提取葎草黃酮的各因素的顯著性，以及因素之間相互作用的關聯(lián)程度，并且得到了提取的最佳作用條件：微波功率422.81 W、提取時間25.89 min、液料比20.82∶1，此時葎草總黃酮的得率達1.83%，模型經(jīng)驗證后結果穩(wěn)定偏差不大，說明響應曲面法優(yōu)化提取葎草黃酮是可行的。

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