宋秋荷，王 魯，葛 蘭，邢曉婧，鐘白玉，郝 飛

現(xiàn)階段流行病學調(diào)查研究表明，早期快速、準確檢測白念珠菌對于念珠菌感染的確診及制定有效的治療方案十分重要。已有研究對抗白念珠菌芽管胞壁外膜單克隆抗體MAb03.2 C1-C2的早期快速實驗室診斷白念珠菌感染打下了一定的基礎，但對于不同實驗室中保存的菌種或不同地域分離的臨床菌株是否能得到同樣的結論還需要進一步驗證。此外，還需要擴展并確定該單抗在臨床中檢測白念珠菌的意義。為此，本文對該單克隆抗體特異性及臨床的拓展應用進行較大樣本的研究，以探討其應用于實驗室檢測的可行性。

1 資料與方法

1.1 菌株來源及鑒定

白念珠菌標準株ATCC-90028、都柏林念珠菌CCCCM IDC8a及類星形念珠菌CCCCM IDC7為第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院皮膚科保存菌株。白念珠菌及其他非白念珠菌的酵母菌為重慶市第一人民醫(yī)院真菌室和九江學院臨床醫(yī)院皮膚科的臨床分離株。金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌由第三軍醫(yī)大學臨床微生物教研室贈送。臨床分離株通過血清芽管試驗及厚壁孢子試驗初步鑒定為白念珠菌及非白念念珠菌。白念珠菌通過45℃溫度生長及木糖同化試驗后進一步鑒定 ，非白念念珠菌通過API 20C AUX 鑒定板條進行鑒定。

1.2 靜止態(tài)ATCC-90028孢子誘導芽管形成 參考方法[1]。

1.3 臨床分離白念珠菌孢子誘導芽管形成 參考方法[1]。

1.4 非白念念珠菌菌絲誘導 參考孫仁美等[2]方法。

1.5 金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的培養(yǎng)和鑒定

1.5.1 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)和鑒定 將金黃色葡萄球菌接種入7.5%NaCl肉湯中，37℃增菌培養(yǎng)24h；再將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37℃分離培養(yǎng)24h。從平板上挑取可疑菌落進行革蘭氏染色觀察、血漿凝固酶試驗、耐熱核酸酶試驗。

1.5.2 綠膿假單胞菌培養(yǎng)和鑒定

普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h觀察，并繼續(xù)培養(yǎng)至72h可產(chǎn)生菌膜。

1. 6 臨床標本采集

1.6.1 分別在重慶和九江兩地收集臨床口腔念珠菌病患者口腔真菌涂片標本和陰道念珠菌病患者陰道真菌涂片標本中鏡檢菌絲陽性標本，并將其涂片風干，4℃保存?zhèn)溆?。標本進行常規(guī)的真菌培養(yǎng)鑒定。

1.6.2 留取系統(tǒng)性真菌感染患者分泌物或血樣標本真菌培養(yǎng)陽性者的靜脈血，離心后取血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 腹水單抗的制備與純化

采用第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院皮膚科自制的抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原雜交瘤細胞株[1]，誘導并純化腹水單抗MAb03.2 C1-C2，具體操作參考徐志凱等[1,3]方法。

1.7.1 動物種類與來源 6～8 周雌性BALB/c 小鼠，購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.7.2 小鼠體內(nèi)誘導-腹水法，參考方法[1]。

1. 8 間接免疫熒光

1.8.1 抗原包被 用帶不完全1640液誘導的ATCC-90028帶芽管孢子作抗原包被載玻片，陰性及陽性對照。臨床分離的念珠菌孢子和菌絲、常見酵母菌孢子、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、臨床口腔念珠菌感染患者假膜涂片及陰道念珠菌病患者白帶涂片作抗原包被玻片。

1.8.2 間接免疫熒光（IIF）法 腹水單抗為一抗（1︰100稀釋），異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠IgG （工作濃度1︰100）為二抗，行常規(guī)的IIF法。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

用確定的臨床凍存的系統(tǒng)性真菌感染患者血清為抗原包被酶標板，封閉后與腹水單抗37℃孵育1 h，洗滌后加辣根過氧化物（HRP）標記的羊抗鼠IgG（工作濃度1︰5000），孵育及洗滌同上，加鄰-苯二胺（orth-phenylene diamine，OPD）底物顯色20min后終止反應，以上每步均用PBS加Tween20洗滌液洗滌3次，每次3min，同時設陰性和空白對照。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果

臨床分離株共計135株白念珠菌，61 株8種非白念念珠菌，4株新型隱球菌。

2.2 ATCC-90028靜止態(tài)孢子誘導芽管結果

得到ATCC-90028帶芽管孢子，芽管誘導率＞95%。

2.3 臨床分離白念珠菌芽管或菌絲誘導結果

得到臨床分離白念珠菌帶芽管孢子，芽管誘導率＞68%。

2.4 非白念念珠菌、新型隱球菌菌絲誘導

61例8種非白念念珠菌中除光滑念珠菌外均可誘導出菌絲。新型隱球菌未見芽管或菌絲形成（表1）。

表1 臨床分離的非白念念珠菌（61例）及新型隱球菌（4例）菌絲誘導結果

2.5 腹水單抗的制備

誘生小鼠腹水單抗,并用IIF檢測到腹水抗體滴度可達1: 25600。

2.6 間接免疫熒光

2.6.1 135例臨床分離白念珠菌孢子表面熒光均為陰性，芽管或菌絲表面熒光均為陽性（圖1）。

圖1 白念珠菌芽管顯示熒光，孢子不顯示熒光

2.6.2 新型隱球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌表面均不存在熒光。

2.6.3 口腔念珠菌病和陰道念珠菌病患者臨床標本經(jīng)實驗室常規(guī)鑒定，其中122例口腔念珠菌病患者中84例為白念珠菌（68.85%），38例為非白念念珠菌。78例陰道念珠菌病患者中，51例為白念珠菌（65.38%），27例為非白念念珠菌。135例白念珠菌孢子表面熒光均為陰性，菌絲表面熒光均為陽性。而65例臨床分離的非白念念珠菌及新型隱球菌的芽管和孢子上均有熒光（圖2） 。

圖2 非白念念珠菌孢子和芽管均顯示熒光

2.6.4 系統(tǒng)性真菌感染患者血清學ELISA檢測結果

臨床通過標本培養(yǎng)共確診深部真菌感染7例，其中3例為白念珠菌菌血癥，2例肺曲霉病，2例新型隱球菌腦炎。用單抗進行血清學ELISA法檢測，3例白念珠菌菌血癥中全部陽性，2例肺曲霉病和2例新型隱球菌腦炎均為陰性。

3 討論

近20年來，由于抗生素、免疫抑制劑及皮質(zhì)類固醇激素在臨床上的廣泛應用，以及器官移植、導管插管和放療、化療等治療技術的開展，尤其是免疫抑制或免疫缺陷的患者在不斷地增加[4,5]，導致系統(tǒng)性真菌的感染率逐年上升，增加約40倍，且死亡率高[6]。國內(nèi)統(tǒng)計中占住院患者病死率的29%（無真菌感染者僅為17%），國外占院內(nèi)感染的25%[6]。在發(fā)達國家，器官移植受者和惡性腫瘤病人中系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率高達20%～40%，而且往往是致命的感染[7]。

白念珠菌感染率已由1986年的5.0%驟升到1996年的19.6%，從而躍居系統(tǒng)性真菌感染的第一位。白念珠菌及同屬的其他菌種對系統(tǒng)性抗真菌藥物如唑類藥的敏感性不同，因此快速診斷并將念珠菌鑒定到種對于確定有效的治療十分重要[4,8]。針對白念珠菌在致病時所具備或釋放的某些特異性抗原的檢測已經(jīng)成功地運用到臨床檢測工作中，如白念珠菌烯醇化酶，白念珠菌胞壁重要成分磷脂酶和天冬氨酸蛋白酶等[9-12]。

白念珠菌是生物有機體內(nèi)的雙相真菌。理論上，當白念珠菌系統(tǒng)性感染時，同源可溶性抗原釋放入血，白念珠菌形態(tài)可發(fā)生改變，由孢子相轉向芽管相，因此在血中檢測到白念珠菌芽管或菌絲的特異性抗原，可以最后確診為系統(tǒng)性白念珠菌感染[13]。而單克隆抗體因為其高度的特異性可以作為血清檢測的主要成分。

在此之前，很多學者進行了抗白念珠菌芽管外膜雜交瘤細胞融合實驗，用白念珠菌芽管孢子進行免疫，獲得MAb C7，結果IFA顯示該單抗特異性不強，與白念珠菌、葡萄牙念珠菌、新型隱球菌等菌種均可反應[14,15]，2000年Marot-Leblond 等[16]又成功制備了世界上第一例抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原雜交瘤細胞株，在對其分泌的單抗做了初步分析的同時，對單抗的特異性也進行了驗證，實驗結果顯示其單抗只與白念珠菌及類星形念珠菌的芽管外膜反應。目前，這方面的研究尚無明顯進展，但我們就白念珠菌的生物學特征和臨床致病特點來看，研究白念珠菌芽管胞壁外膜抗原的特性和其抗體的應用，也許是今后解決快速、早期檢測深部白念珠菌感染的一條捷徑。所以我們在成功制備了單抗MAb03.2C1-C2之后，針對該單抗的特異性驗證，進行了多中心多地域的病原體采集和實驗。

本實驗再次應用本科制備的雜交瘤細胞株所對應的抗白念珠菌芽管外膜抗原特異性單抗MAb03.2C1-C2于多地域的臨床分離株和深部白念珠菌感染的檢測，結果顯示單抗的特異性很高，達到100%。在白念珠菌孢子部位及與白念珠菌形態(tài)學上特別接近都柏林念珠菌的芽管和孢子上均無熒光可見，并成功地用此單抗與芽管和菌絲之間的交叉反應來鑒定并區(qū)分臨床中白念珠菌和其他念珠菌、酵母菌、細菌感染。在檢測深部白念珠菌感染時所花費的時間遠遠少于真菌培養(yǎng)的時間,為今后研究該單抗快速、早期地診斷及鑒別深部白念珠菌感染打下了堅實的實驗基礎。因此，在結合并總結前人[2]工作的基礎上，我們初步判斷該株單抗MAb03.2C1-C2是目前惟一一株抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原特異性的單克隆抗體，為該單抗今后在實驗研究和臨床應用中起到進一步先證作用。

[1]宋秋荷, 王魯, 李元忠, 等. 抗白念珠菌芽管單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及其對血清芽管誘導率的影響 [J]. 中國皮膚性病學雜志, 2005, 19(11):650-653.

[2]孫仁美, 王魯, 唐書謙, 等. 抗白念珠菌芽管單抗MAb03.2C1-C2特異性及臨床初步應用研究 [J]. 中國皮膚性病學雜志, 2006,11(20):658-661.

[3]徐志凱. 實用單克隆抗體技術 [M]. 西安:陜西科學技術出版社,1992, 93-142.

[4]Calderone RA, Fonzi WA. Virulence factors of Candida albicans [J].Trends Microbiol, 2001, 9(7):327-335.

[5]Niewerth M, Korting HC. Phospholiases of Candida albicans [J].Mycoses, 2001, 44(9-10):361-367.

[6]Nitz M, Ling CC, Otter A, et al. The unique solution structure and immunochemistry of the Candida albicans beta -1,2-mannopyranan cell wall antigens [J]. J Biol Chem, 2002 , 277(5):3440-3446.

[7]李若瑜, 李東明, 余進, 等.真菌與真菌病研究近況 [J]. 北京大學學報(醫(yī)學版), 2002, 34(5):559.

[8]Moter A, Gobel UB. Fluorescence in situ hybridization (FISH)for direct visualization of microorganisms [J]. J microbiol Methods, 2000, 41(2):85-112.

[9]Sundstrom P, Jensen J, Balish E. Humoral and cellular immune responses to enolase after alimentary tract colonization or intravenous immunization with Candida albicans [J]. J Infect Dis, 1994, 170:390-395.

[10]Sugiyama Y, Nakashima S, Mirbod F, et al. Molecular cloning of a second phospholipase B gene, caPLB2 from Candida albicans[J]. Med Mycol, 1999, 37(1):61-67.

[11]Leidich SD, Ibrahim AS, Fu Yue, et al. Cloningand disruption of caPLB1, a phospholipase B gene involved in the pathogenicity of Candida albicans [J]. J Biol Chem, 1998, 273(40):26078-26086.

[12]Kantarcioglu AS, Yucel A. Phospholipase and protease activities inclinical Candida isolate with reference to the sources of strains[J]. Mycoses, 2002, 45:160-165.

[13]Paula MS, George K. Characterization of antigens specific to the surface of germ tubes of Candida albicans by immunofluorescence [J]. Infect Immun, 1984, 43(3):850-855.

[14]Marot-Leblond A, Robert R, Aubry J, et al. Identification and immunochemical characterization of a germ tube specific antigen of Candida albicans [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 1993,7(2):175-186.

[15]Moragues MD, Omaetxebarria MJ, Elguezabal N, et al. A monoclonal antibody directed against a Candida albicans cell wall mannoprotein exerts three Anti-C. albicans Activities [J].Infect Immun, 2003, 71(9):5273-5279.

[16]Marot-Leblond A, Grimaud L, Nail S, et al. New monoclonal antibody specific for Candida albiccans germ tube [J]. J Clin Microbio, 2000, 38(1):61-67.