石學(xué)魁，阮殿清，陶 冀，周明瑤，王亞賢

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，牡丹江 157011；2.木蘭縣疾病控制中心，哈爾濱 151900；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室，哈爾濱 150040）

紅花是一味重要的活血化瘀藥，具有活血、祛瘀、止痛之功效，在歷代醫(yī)書及《本草綱目》中均有詳細(xì)記載，是傳統(tǒng)復(fù)方和現(xiàn)代臨床組方中常用的中藥。紅花成分復(fù)雜，作用多樣。據(jù)研究，紅花的重要成分之一——紅花多糖（SPS）具有免疫調(diào)節(jié)功能，如增加溶血空斑數(shù)量，并能顯著對抗?jié)娔崴梢种迫苎瞻叩淖饔肹1]；紅花多糖也具有抗腫瘤作用[2]。本研究通過檢測人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的增殖作用及PBMC誘生細(xì)胞因子水平，探討SPS對機(jī)體免疫功能的影響，以期為該藥應(yīng)用于抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠T細(xì)胞（CTLL-2，協(xié)和醫(yī)科大學(xué)免疫室惠贈）、人羊膜上皮細(xì)胞（WISH，衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈）、小鼠成纖維細(xì)胞（L929，空軍總院劉麗博士惠贈）。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO－BRL公司）；胎牛血清（FCS，GIBCO－BRL公司）；Ficoll－Urografin淋巴細(xì)胞分離液（上海試劑二廠）；植物凝集素 P（PHA－P，Serva產(chǎn)品）；水皰口炎病毒（VSV，衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈）；重組白細(xì)胞介素－2（rIL－2，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院中化技術(shù)研究所張明偉教授惠贈）；重組腫瘤壞死因子α（rTNF－α）和基因重組干擾素γ（rIFN－γ，邦定生物醫(yī)學(xué)公司）；氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）：比放射活性100 mci/mL（中科院原子能所提供）。

1.3 儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（池本理化株式會社，日本）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；酶標(biāo)微量板測定儀（BIO－T EK INSTRMENTS INC.，美國）。

1.4 紅花多糖的制備 紅花1000g，充分浸漬，90℃提取4 h，邊提邊攪拌，過濾，殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并兩次提取液濃縮至一定體積，加乙醇終濃度至85%。沉淀物加適量水溶解，置分液漏斗中，加氯仿充分振蕩，放置片刻，除去氯仿層，如此反復(fù)操作6次，以除去蛋白質(zhì)。水層加95%乙醇沉淀，沉淀物先后用無水乙醇、乙醚洗滌3次，干燥后即得SPS。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)前配制成不同濃度的多糖水溶液，無菌過濾后冰箱保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PBMC的分離 取健康人外周抗凝血5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液，按常規(guī)方法分離PBMC。將分離出的細(xì)胞用5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3遍，制成細(xì)胞懸液（1×109個/L）。

2.2 PBMC增殖活性檢測 于96孔圓底培養(yǎng)板中每孔加入1×105個人PBMC，分為正常對照組（不加紅花多糖或PHA），植物血球凝集素（PHA）刺激組（PHA終濃度為1g/L），PHA加多糖組（PHA終濃度為1 g/L，紅花多糖濃度為 1.25 g/L），多糖組 1（5 g/L），多糖組2（2.5g/L)，多糖組 3（1.25 g/L），多糖組 4（0.625 g/L），多糖組5（0.312 g/L）。每孔液量為200 μL，作平行3孔。培養(yǎng) 72 h，每孔加3H-TdR 10 μL ，孵育 6 h。用液閃儀測定3H-TdR摻入量，結(jié)果以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示。

2.3 細(xì)胞因子生物活性檢測 于24孔板中每孔加入1×106個PBMC，分組同2.2。每孔總液量為1 mL，每5孔為1個實(shí)驗(yàn)組。刺激48h，每孔取上清500μL，分裝5份檢測細(xì)胞因子。

2.3.1 白介素-2（IL-2）生物活性檢測 取CTLL-2細(xì)胞，洗滌3次，以完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至2×109個/L，按每孔75 μL加入96孔平底培養(yǎng)板中。將IL-2標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個梯度，最大濃度為4×105U/L，每孔25μL，設(shè)平行3孔。另取培養(yǎng)上清25μL加入孔中，每份樣品設(shè)復(fù)孔。對照孔加完全培養(yǎng)基25 μL。5%二氧化碳（CO2）孵箱中孵育 20～22 h，待對照孔細(xì)胞死亡大于90%后，每孔加入噻唑藍(lán)（MTT）15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加溶解液 100 μL，置孵箱中孵育8 h后，酶標(biāo)儀上測其光密度值（OD值），測定波長570 nm，參考波長630 nm。

2.3.2 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）生物活性檢測培養(yǎng)的L929細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞，洗滌2次，用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個/L。按每孔90 μL細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，孵箱中孵育18h細(xì)胞長成單層后，加放線菌素D 10 μL（終濃度800 μg/L）。將TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品5倍稀釋8個梯度，最大濃度為2×108U/L，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測上清樣品10 μL。酶標(biāo)儀檢測同IL-2。

2.3.3 干擾素-γ（IFN-γ）生物活性檢測 用0.25%的胰酶消化培養(yǎng)的羊膜（WISH）細(xì)胞，洗滌2次調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個/L，96孔平底培養(yǎng)板中每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL，5%CO2孵箱中孵育2 h。標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個梯度，最大濃度為5×106U/L，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測上清25 μL，培養(yǎng)過夜，以每孔100 TCID50水泡性口腔炎病毒（VSV）攻擊WISH細(xì)胞，再孵育24 h，待對照組細(xì)胞病變大于75%時結(jié)束培養(yǎng)。以下MTT測定同IL-2測定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SPS對人PBMC增殖活性的影響 經(jīng)SPS作用后，PBMC增殖活性均比正常對照組高，尤以1.25g/L和0.625 g/L劑量組作用顯著（P<0.05），呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用，最適宜促進(jìn)效應(yīng)濃度為0.625 g/L。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較，未見明顯差異，表明SPS對PHA所致的PBMC增殖反應(yīng)無協(xié)同或拮抗作用。PHA組與SPS各組比較差異顯著，說明SPS雖然對PBMC的增殖有促進(jìn)作用，但作用程度遠(yuǎn)低于PHA。見表1。

表1 SPS對人PBMC增殖的影響(n=7，±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7，±s)

表1 SPS對人PBMC增殖的影響(n=7，±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7，±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常對照組植物凝集素對照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.2552.51.250.6250.312每分鐘脈沖數(shù)(cpm)851± 27240398±8727**32950±6142**1131± 2881373± 3452518± 595*4508±1088*1195± 310

3.2 SPS對PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響 SPS對IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用，與正常對照組比較差異顯著（P<0.05），但其作用不及PHA（與正常對照組比較P<0.01）。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較，未見明顯差異，表明SPS對PHA刺激PBMC產(chǎn)生IL-2和IFN-γ無協(xié)同或拮抗作用。TNF-α 各組之間無顯著性差異（P＞0.05），即 SPS對TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用。見表2。

表2 不同濃度SPS對PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7，±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7，±s)103U/L

表2 不同濃度SPS對PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7，±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7，±s)103U/L

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常對照組植物凝集素對照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.251.250.6250.312 IL-216.45±3.3462.56±13.89**64.57±14.28**38.78±7.98*44.54±9.23*34.12±6.54*IFN-γ 23.55±4.43157.44±29.69**148.67±27.87**76.45±13.87*98.65±17.45*88.43±16.13*TNF-α 5.66±1.766.12±2.346.67±2.894.30±1.454.98±1.895.54±2.86

4 討論

紅花具有抗腫瘤作用，在于其活血、祛瘀、止痛之功效。腫瘤在中醫(yī)學(xué)中相當(dāng)于噎膈、癥積、石瘕、痞癖、腸覃、肚腹結(jié)塊等，且歷代醫(yī)家也多認(rèn)為腫瘤與瘀血有密切關(guān)系，如王清任《醫(yī)林改錯》中指出：“肚腹結(jié)塊者，必有形之血。”說腹內(nèi)腫塊，多由血瘀所致，故活血化瘀法是治療腫瘤的主要法則之一。在多種癌癥的臨床治療中以紅花為主藥單用或適當(dāng)配伍，常常獲得良好療效，原因在于此。紅花多糖是紅花的主要成分之一，作為免疫調(diào)節(jié)劑具有抗腫瘤作用。本研究紅花多糖（SPS）對PBMC的增殖及PBMC分泌細(xì)胞因子的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究紅花多糖的抗腫瘤機(jī)制打下基礎(chǔ)。

PBMC主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，而以T細(xì)胞占多數(shù)。T細(xì)胞承擔(dān)著抗微生物、移植物排斥和腫瘤的免疫監(jiān)視等一系列重要生理功能，是細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者，在體內(nèi)通過分泌IL-2而發(fā)揮一系列重要的免疫效應(yīng)。IL-2主要由CD4、CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生，可激活單核/巨噬細(xì)胞，并增強(qiáng)其殺瘤活性；促進(jìn)自然殺傷（NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）增生；激活B細(xì)胞及產(chǎn)生抗體等。淋巴細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞（IFN-γ）能促進(jìn)CTL成熟及活性；激活NK細(xì)胞殺傷活性；激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其活性。研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥多糖及中藥提取物就是通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[3-5]。有些中藥復(fù)方也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及提高細(xì)胞因子如IL-2的分泌[6]。實(shí)驗(yàn)中，SPS促進(jìn)PBMC的增殖，進(jìn)而增強(qiáng)其活性，有助于提高機(jī)體的細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗腫瘤、抗感染等作用。SPS誘導(dǎo)PBMC分泌大量細(xì)胞因子，尤其是1.25 g/L和0.625 g/L劑量作用顯著。說明SPS具有明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化以及促進(jìn)內(nèi)源性IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生。其結(jié)果表明這些細(xì)胞因子是SPS發(fā)揮藥效的分子介質(zhì)和物質(zhì)基礎(chǔ)，是增強(qiáng)機(jī)體對各種有害因素的非特異性抵抗力的藥效機(jī)制之一。

另外，SPS對TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用，其原因?qū)⑦M(jìn)一步研究。

綜上所述，紅花多糖（SPS）可促進(jìn)人PBMC增殖，提高PBMC分泌IFN-γ、IL-2，具有免疫調(diào)節(jié)作用。因此，SPS可作為免疫調(diào)節(jié)劑而用于腫瘤治療。

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