姜燕華，段云裳，王麗鴛，周 健，曾建明，成 浩*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學茶葉科學研究所，江蘇 南京 210095）

福建省茶樹栽培歷史悠久，是我國茶樹無性系品種的起源地。廣大茶農(nóng)在長期的生產(chǎn)實踐中，篩選和培育了大批的無性系地方（農(nóng)家）品種。這些地方品種中的部分優(yōu)異者，如福鼎大白茶、政和大白茶、黃惔等在生產(chǎn)實際中的應(yīng)用和分布較廣，1985年被全國農(nóng)作物品種審定委員會認定為第一批國家級良種，其中部分品種在20世紀60年代后被推廣引種到全國各地的產(chǎn)茶省份，并成為各地茶樹育種機構(gòu)所經(jīng)常采用的育種親本。同時，近幾十年來，福建省還采用單株選育、雜交等方法培育了福云系列、鐵觀音黃惔系列等一大批茶樹良種，是我國茶樹育成品種數(shù)較多的省份之一[1～5]。

分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。目前已經(jīng)發(fā)展出多種標記方法，如RAPD、ISSR、SSR等，這些標記不僅在水稻[6]、小麥[7]等農(nóng)作物上，還在馬蘭[8]、朱砂根[9]等藥科植物上得到廣泛應(yīng)用。SSR（simple sequence repeats）標記又稱微衛(wèi)星（microsatellite）標記，是由1 ～ 6個核苷酸組成的簡單重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中。SSR標記具備多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性和易于使用等特點，是目前應(yīng)用最廣的分子標記之一。在茶樹物種研究中，多種分子標記都得到一定應(yīng)用[10～11]，我國茶樹 SSR標記的建立始于金基強等人[12]的研究。隨后，茶樹 SSR標記得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。姚明哲等[13]采用EST-SSR引物對我國江北茶區(qū)進行多態(tài)性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，認為種質(zhì)資源沒有出現(xiàn)明顯的地區(qū)分化；王麗鴛等[14]利用SSR標記對茶組資源間親緣進化進行研究，構(gòu)建出茶組12個種的遺傳進化關(guān)系圖；劉振等[15]通過EST-SSR標記對福建省茶樹資源多態(tài)性進行研究，發(fā)現(xiàn)福建省茶樹資源具有較高的遺傳多樣性；而黃建安等[16]將毛細管電泳四色熒光檢測技術(shù)與SSR標記結(jié)合，使得SSR標記在茶樹上的應(yīng)用更為方便和可靠，且成本大大降低。但目前采用SSR標記來探討人為選擇對我國茶樹品種多態(tài)性影響的系統(tǒng)分析還沒有。

本文采用SSR分子標記方法，對福建省茶樹地方品種和育成品種的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)進行了比較分析，并討論人為選擇對茶樹品種遺傳多態(tài)性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

60份試驗材料（表1）來源于中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所國家茶樹種質(zhì)資源圃和福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所種質(zhì)資源圃，包括31份地方品種（其中15份經(jīng)國家或省級審（認）定）和29份近代育成品種（系）[5,17]。于4月下旬采集一芽二葉新梢，置－80℃冰箱中備用。

表1 參試茶樹品種名稱和來源Table 1 Name and origin of the tested 60 tea varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 將材料于液氮條件下研磨成細粉，參照劉本英[18]CTAB法進行改進提取基因組DNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測所提DNA，用Shimadzu UV2550（日本津島公司）分光光度儀定量檢測純度和濃度，最后將DNA濃度稀釋標定到20 ng/μL，置于－20℃冰箱備用。

1.2.2 引物確定 引物由中國農(nóng)業(yè)科學院茶樹資源與改良中心自主開發(fā)，選取多態(tài)性較好的36對SSR引物用于本次實驗標記，部分引物信息見表2及王麗鴛等人研究[19]。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表2 部分EST-SSR引物信息Table 2 Information of parts of EST-SSR primer pairs

1.2.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)總體積10.0 μL，在PTC-200型PCR儀（MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA）上進行，具體反應(yīng)步驟為：94℃預(yù)變性4 min→35個循環(huán)的變性（94℃ 30s）→退火（溫度隨引物不同而不同，45s）→延伸（72℃ 30s）→72℃下繼續(xù)延伸10 min→4℃保溫[20]。

1.2.4 產(chǎn)物檢測 采用 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離檢測，在 Bio-Rad 300型電泳儀（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）上電壓設(shè)定為160 V，時間150 min，電泳結(jié)果用銀染檢測。用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像儀進行拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對同一個SSR引物的擴增條帶（等位變異）在各參試資源中記錄有或無。同一位置條帶如果無或模糊不易分辨，則記為“0”；如果有清晰條帶，則記為“1”，用 Excel表存儲，再按照各種不同的軟件進行相應(yīng)格式的轉(zhuǎn)換。

參試資源某一位點的等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、期望雜合度（He）、Nei氏多樣性指數(shù)（Nei）、平均遺傳距離（Mean. D）以及Shannon信息指數(shù)（I）等數(shù)據(jù)統(tǒng)計在Popgene 1.32軟件包中完成；基因型（GenoType）和多態(tài)性信息含量（PIC）在Powermarker Ver.3.25中完成；根據(jù)Nei氏遺傳距離，按非加權(quán)類平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging, UPGMA），采用Popgene 1.32軟件結(jié)合MEGA 3.1分析軟件[21～22]對60份參試材料進行聚類并繪制聚類圖。

采用structure2.3軟件對60份供試材料進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，按照似然值最大的原則選取合適的K值，得到基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖[23～24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試材料的多態(tài)性分析

采用36對SSR引物對60份材料進行多態(tài)性分析，共檢測到165條多態(tài)性條帶，平均每對引物檢測到4.58條（圖1）；所得基因型共343個，平均為9.53個；平均多態(tài)信息量（PIC）0.54。

將參試材料分為基本未獲推廣應(yīng)用的未審（認）定地方品種、品質(zhì)性狀優(yōu)異而獲得較大面積推廣應(yīng)用的審（認）定地方品種和現(xiàn)代育成品種3類，分別計算他們的多態(tài)性數(shù)據(jù)，并將生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的審（認）定地方品種和現(xiàn)代育成品種合并作為一組，并計算了多態(tài)性各項數(shù)據(jù)。其結(jié)果（表 3）表明，前三組的多態(tài)性從高到低依次為未審（認）定地方品種＞育成品種＞審（認）定地方品種。而后兩組合并成推廣應(yīng)用品種組后，其多態(tài)性結(jié)果仍低于未審（認）定地方品種組。但是，現(xiàn)代育成品種間的平均遺傳距離卻大于地方品種間的平均遺傳距離。

圖1 引物A58對60份福建茶樹材料的擴增電泳圖Figure 1 The amplification result of primer A58 for the 60 tea varieties from Fujian

2.2 參試材料的親緣關(guān)系分析

由60份參試資源的聚類結(jié)果（圖2）表明，在分支長度為 0.2883時，參試材料被劃分為A1和A2兩大類。

其中A1大類所聚的 15份供試材料全部屬于未審（認）定的地方品種，如矮腳烏龍、臘面和張儀等；A2大類包括的是在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用較多的國家（?。┘墝彛ㄕJ）定地方品種和現(xiàn)代育成品種，這一大類中還出現(xiàn)了4個聚集較為緊密的小亞群，其中B類主要為福鼎大白茶與云南大葉茶的雜交后代如福云6號、7號等，以及與福鼎有關(guān)的一些品種如福鼎大毫茶、早逢春、霞浦春波綠；D1類大部分是鐵觀音和黃棪的雜交后代如黃觀音、黃玫瑰、紫玫瑰等，和鐵觀音同樣來自于安溪的鳳圓春，以及兩個來自武夷山的品種九龍袍和丹桂；而D2類中大部分是原產(chǎn)于安溪縣獲國家級認定的地方品種，如毛蟹、鐵觀音、黃棪等。

60份供試材料中遺傳距離最大的是大紅和紅芽佛手，都屬于地方品種，為1.87。而黃玫瑰和紫玫瑰由于遺傳背景非常接近[25]，他們之間的遺傳距離最小，只有0.02。

圖2 60份茶樹材料的UPGMA聚類圖Figure 2 Dendrogram of PopGen cluster

2.3 參試材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，當K = 2時，能夠取到最大似然值，此時供試材料被分為兩大類群：I亞群和Ⅱ亞群（圖3），兩大亞群分離明顯，具有明顯的結(jié)構(gòu)差異。

其中第I亞群包括15份供試材料，占總參試材料的25%，全部為未審（認）定地方品種，與聚類分析結(jié)果中的A1類完全一致；剩下的45份參試資源分布于亞群Ⅱ，占總數(shù)的75%。

圖3 60份材料的遺傳結(jié)構(gòu)Figure 3 The genetic structure of 60 tea germplasms from Fujian

3 討論

本文采用的聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析都將60份參試材料以相同的方式分成了兩大類，第一大類囊括了15個未經(jīng)審定的地方品種，這些品種資源的共同特點是在生產(chǎn)實踐上獲得的認可度較低，因而沒有獲得規(guī)?；耐茝V應(yīng)用。而另一大類則包括了在生產(chǎn)中獲得了較大規(guī)模推廣應(yīng)用的、已經(jīng)獲得國家或省級審（認）定的地方品種和其他所有的現(xiàn)代育成品種，這些品種的共同特點是其品質(zhì)性狀都較為符合近現(xiàn)代茶葉生產(chǎn)的需求，獲得茶葉生產(chǎn)經(jīng)營者認同度較高。因此，這樣兩種來源的品種被歸入同一大類的原因之一，可能就在于他們都是經(jīng)歷了較為強烈的人為篩選后所留下的幸運兒，而這些人為篩選的目標或者標準，因為都是以生產(chǎn)實際為指導的，因而是基本相同或近似的，由此導致了他們在較多的性狀位點上趨于同質(zhì)化。這兩類品種材料的多態(tài)性指標數(shù)值低于未經(jīng)審（認）定地方品種組的事實，同樣表明了他們遺傳多樣性程度的被降低。

表3 不同類型品種的多態(tài)性比較Table 3 Polymorphic comparison among different groups

審（認）定地方品種和現(xiàn)代育成品種被歸入同一大類的另一個影響因素可能來自于以下事實，在29個育成品種中，多數(shù)（19個）都與福鼎大白茶、鐵觀音和黃惔這三個地方品種中的一個或兩個有親緣關(guān)系，它們或者是這三個地方品種的雜交后代，或者是從這三個地方的種子后代中篩選出來的，因而使得這兩類材料間的遺傳背景變得更為相近。但是，另一方面，來自于云南的云南大葉茶作為雜交親本的引入，可能是導致育成品種間平均遺傳距離增大的原因。因此，從以上分析可以看出，帶有相同或相似目的的人為選擇，確實降低了生產(chǎn)上推廣使用的茶樹品種的遺傳多樣性。

致謝：在研究過程中得到了福建省茶葉研究所郭吉春研究員的大力幫助，在此謹表謝意。

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