諶江華，陳若霞，李 斌

(1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040;2.浙江大學生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310029)

黃瓜苗期猝倒病是黃瓜育苗中的常見病害，一般苗床發(fā)病率為20%～50%，嚴重時可達80%以上［1］。特別是在設施栽培條件下，黃瓜苗期猝倒病發(fā)生更加普遍，危害日趨嚴重，已成為影響黃瓜育苗的首要問題。黃瓜苗期猝倒病主要由腐霉菌(Pythium spp.)引起，生產(chǎn)上主要采用甲霜靈拌種或土壤處理來防治?；瘜W農(nóng)藥雖能在一定程度上防控該病，但同時也帶來了農(nóng)藥殘留超標、環(huán)境污染和病害抗藥性等一系列問題［2］。殼聚糖(chitosan)是甲殼素 (chitin)脫乙酰基后形成的一種高分子陽離子多聚糖，廣泛存在于真菌的細胞壁及蝦、蟹等甲殼動物外殼中。殼聚糖能誘導植物產(chǎn)生多種抗病性反應［3－5］，對多種植物病原微生物有明顯的抑制作用［6－8］。此外，殼聚糖具有無毒、施用后可被土壤微生物完全降解，不會對土壤微環(huán)境造成不利影響等優(yōu)點，這使其有可能作為一種新型的綠色農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用［9］。近年來，關(guān)于殼聚糖誘導植物抗病反應和對一些植物病原菌抑制作用的研究已有不少報道，但有關(guān)殼聚糖不同產(chǎn)品不同濃度對蔬菜苗期猝倒病的防控效果則未見系統(tǒng)報道。本研究以黃瓜種子為試驗材料，通過殼聚糖不同產(chǎn)品、不同濃度的離體抑菌活性和活體條件下不同產(chǎn)品、不同施用量對黃瓜猝倒病的防控效果的研究，為黃瓜的無公害栽培，特別是壯苗培育提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試殼聚糖:殼Ⅰ (國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn))，殼Ⅱ (上海藍季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))，殼Ⅲ (浙江仙居縣滕旺殼聚糖廠生產(chǎn))，3種殼聚糖均為白色粉末，脫乙酰度大于95%。

供試病原菌為黃瓜猝倒病菌瓜果腐霉(Pythium.aphanidermatum)，F(xiàn)C42菌株，由浙江大學生物技術(shù)研究所提供。

供試黃瓜種子品種為津綠4號 (引自天津黃瓜研究所)。洗去黃瓜種子表面的種衣劑，并用75%酒精消毒1 min后，放入溫水中浸種3 h，然后用紗布包裹放到30℃培養(yǎng)箱中催芽24 h后用于播種。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖母液的配制

準確稱取一定量殼聚糖溶于2%冰醋酸溶液，pH調(diào)至6.5，配制成5 mg·mL－1的殼聚糖母液，121℃高壓蒸氣滅菌30 min后備用。

1.2.2 殼聚糖離體抑菌效果的測定

殼聚糖離體抑菌效果測定采用平板含毒介質(zhì)法。將預先做好的PDA培養(yǎng)基熔化，當培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，分別加入適量的殼聚糖母液，制 成 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 和 1.5 mg·mL－17個不同濃度的含殼聚糖 PDA培養(yǎng)基，迅速搖勻后倒入9 cm直徑的培養(yǎng)皿中，制成含毒PDA平板。在平板中央接上1塊0.5 cm直徑的1日齡PDA腐霉菌餅。試驗設不加殼聚糖溶液為空白對照 (CK)，每處理平板重復3次。接完菌后，放入25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，24和36 h后，十字交叉法測量菌落直徑2次，求平均值。根據(jù)下式計算出抑制率。

抑制率 (%) =［(CK的菌落直徑－處理菌落直徑)/(CK菌落直徑－5)］×100。

1.2.3 殼聚糖防控黃瓜苗期猝倒病效果的活體測定

殼聚糖防控黃瓜苗期猝倒病效果的活體測定采用毒土法。以高溫滅菌土壤為基質(zhì)，拌入殼聚糖，拌好后裝于育苗盤內(nèi)，然后將催好芽的黃瓜種子播于育苗盤的土上，種子旁邊接種1塊0.5 cm直徑的1日齡PDA腐霉菌餅，菌面朝下，蓋土，盤內(nèi)加適量去離子水以保持土壤濕潤。試驗設殼Ⅰ不同施用量處理和不同殼聚糖產(chǎn)品0.5 g·kg－1處理2組試驗。第1組試驗設不接菌 (CK)、腐霉、腐霉+ 殼Ⅰ 0.25 g·kg－1、腐霉 + 殼Ⅰ 0.5 g·kg－1和腐霉 +殼Ⅰ 1.0 g·kg－15個處理;第2組試驗設不接菌 (CK)、腐霉、腐霉+殼Ⅰ、腐霉+殼Ⅱ和腐霉+殼Ⅲ 5個處理。重復3次，每重復24穴，每穴1顆黃瓜種子。

將處理好的育苗盤放入人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為白天16 h和21℃，黑暗8 h和19℃，相對濕度85%，光照強度為10只BMC T5-25 W燈管，7 000 lx左右。各處理出苗后調(diào)查出苗率、發(fā)病率。收集健康植株，洗凈泥土后放入80℃烘箱中烘干24 h，最后分別稱量根、莖干重，計算單株根、莖干重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用唐啟義等［10］的 DPS軟件采用鄧肯氏新復極差法 (DMRT)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對腐霉菌的離體抑菌效果

離體抑菌試驗結(jié)果表明，殼聚糖對腐霉菌具有直接的抑制作用。殼聚糖對腐霉菌的抑制率與殼聚糖的濃度呈正相關(guān)，濃度越大抑制率越高。不同殼聚糖產(chǎn)品對腐霉菌的抑制效果不同。3種殼聚糖中殼Ⅱ的抑制效果最好，0.8 mg·mL－1濃度24 h的抑制率即達100%，殼Ⅰ和殼Ⅲ的抑制效果較差，1.5 mg·mL－1濃度的抑制率才達 100% (表 1)。另外，比較培養(yǎng)24和36 h的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對腐霉的抑制效果隨培養(yǎng)時間而變化，培養(yǎng)時間延長，抑制率降低。綜合以上結(jié)果可以看出，殼聚糖抑制腐霉菌菌絲生長受到殼聚糖產(chǎn)品自身品質(zhì)、殼聚糖溶液濃度和培養(yǎng)時間的影響。

表1 殼聚糖離體抑菌的效果

2.2 殼聚糖對黃瓜猝倒病的活體防控效果

殼Ⅰ活體控病試驗結(jié)果表明，土壤中施用殼聚糖對黃瓜猝倒病有較好防控效果。殼聚糖不同施用量對黃瓜猝倒病的防控效果不同 (表2)。施用0.5 g·kg－1殼聚糖對黃瓜猝倒病能起到較好的防控效果，處理后3 d的出苗率為65.28%，顯著高于腐霉處理的6.94%，處理后7 d猝倒病發(fā)病率顯著下降，為35.97%。殼聚糖施用量提高到1.0 g·kg－1時，防控效果則更加顯著提高，3 d后出苗率達76.39%，7 d后防治效果達80.21%。根、莖干重結(jié)果分析表明，殼聚糖施用后，植株生長增強，根、莖干重顯著高于腐霉處理。

表2 殼聚糖不同施用量對黃瓜猝倒病的防控效果

試驗結(jié)果還表明，不同殼聚糖產(chǎn)品對黃瓜猝倒病的防控效果差異明顯，且不同時段防控效果不同。3種殼聚糖中殼Ⅱ在出苗前對猝倒病的防控效果較好，出苗率為72.22%，顯著高于殼Ⅰ和殼Ⅲ，但出苗后殼Ⅱ的防控效果則不如殼Ⅰ和殼Ⅲ，出苗后7 d的防效為45.86%，明顯低于殼Ⅰ和殼Ⅲ的58.13%和56.41%，根、莖干重也低于殼Ⅰ和殼Ⅲ (表3)。綜合以上試驗結(jié)果可以得出，殼聚糖對蔬菜猝倒病的活體防控效果除受到殼聚糖的施用量影響外，自身的品質(zhì)也很重要。

表3 不同殼聚糖對黃瓜猝倒病的防控效果

3 小結(jié)與討論

離體抑菌試驗結(jié)果表明，殼聚糖直接抑制黃瓜苗期猝倒病菌的生長，但抑制效果因殼聚糖產(chǎn)品理化性質(zhì)、使用濃度及培養(yǎng)時間的不同而異。供試3種殼聚糖中殼Ⅱ?qū)Ω咕囊种菩Ч糜跉あ窈蜌あ?，殼Ⅱ采?.8 mg·mL－1試驗濃度，在 PDA上培養(yǎng)24 h的抑制率可達100%，顯著高于殼Ⅰ和殼Ⅲ相同試驗濃度PDA上培養(yǎng)24 h的抑制率。殼聚糖低濃度時，抑制率隨濃度增加而提高。培養(yǎng)時間延長，抑制率下降。

活體控病試驗結(jié)果表明，殼聚糖在活體條件下對黃瓜苗期猝倒病有較好的防控作用，其防控效果與殼聚糖的施用量呈正相關(guān)關(guān)系，土壤中添加0.5 g·kg－1殼聚糖對黃瓜猝倒病能起到較好的防控效果，施用量提高到1.0 g·kg－1，防控效果明顯提高，根、莖干重均顯著增加。不同產(chǎn)品殼聚糖對黃瓜猝倒病的防控效果差異顯著。同時，殼聚糖自身作為一種有機物質(zhì)，對植物的生長具有明顯的促進作用。

已有的研究表明，殼聚糖防控植物病害的機制主要有2個方面。一方面是殼聚糖對植物病原菌的直接抑制作用，殼聚糖為甲殼素的多聚陽離子衍生物，可與病原菌細胞表面的帶負電的物質(zhì) (如蛋白質(zhì)等)相互作用，形成聚合物影響病原菌細胞膜的正常生理功能，同時殼聚糖還可直接進入病原菌細胞內(nèi)與胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)相互作用，干擾細胞正常代謝，從而抑制病原菌的生長［11］;另一方面，殼聚糖還能誘導植物產(chǎn)生廣譜抗性的機制。施用殼聚糖直接抑制病原菌生長或誘導植物產(chǎn)生抗病反應，是提高植物對病害的抗性，減少化學農(nóng)藥施用量的有效途徑。殼聚糖無毒、無害、來源豐富，是農(nóng)產(chǎn)品無公害生產(chǎn)中極具應用潛力和有待開發(fā)的一種環(huán)保型農(nóng)藥和植物抗病誘導物，具有廣闊的應用前景。

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