黃楚珠，黃偉哲，梁結(jié)玲，肖大偉（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，汕頭市 515041）

阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，它能產(chǎn)生氧自由基而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，常被用于誘導(dǎo)非缺血性心肌病模型。目前國(guó)內(nèi)、外多采用兔、大鼠[1]作為阿霉素的誘導(dǎo)對(duì)象，但由于采用這2種動(dòng)物為對(duì)象具有體質(zhì)量大、用藥多、費(fèi)用高、誘導(dǎo)心肌病模型的時(shí)間過長(zhǎng)（一般8～12周）的缺點(diǎn)，為此，筆者采用小鼠作為誘導(dǎo)對(duì)象，必將節(jié)省大量費(fèi)用。本研究通過一次性注射大劑量阿霉素的方式，短時(shí)間內(nèi)建立小鼠非缺血性心肌病模型，并用高頻率超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)其可行性。

1 材料

1.1 動(dòng)物

BALB/c小鼠78只，♂，體質(zhì)量22～24 g，周齡8～12周，由香港中文大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)：2005A018。

1.2 試藥

阿霉素注射液（澳洲Ebewe公司，批號(hào)：406151，規(guī)格：2 mg·L－1）。

1.3 儀器

SONOS7500多普勒超聲診斷儀（美國(guó)飛利浦公司）；AxioplanⅡimaging熒光相差倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；TECNAI10透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）。

2 方法

2.1 超聲心動(dòng)圖檢查

小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，各39只。給藥前所有小鼠均接受超聲心動(dòng)圖檢查，獲取基礎(chǔ)狀態(tài)超聲指標(biāo)。給藥組經(jīng)腹腔一次性注射阿霉素20 mg·kg－1[2]，對(duì)照組注射同容量的生理鹽水。2組在給藥后第3、4、5天進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。超聲檢查前2～3 d重復(fù)訓(xùn)練清醒狀態(tài)下的小鼠[3]。訓(xùn)練方法：左手捉鼠，右手將探頭固定于小鼠左胸前壁，模仿超聲過程，一般重復(fù)6～8次，直至小鼠心率穩(wěn)定于540～650次·min－1，隨后剔除左胸前壁鼠毛。實(shí)驗(yàn)超聲檢查由2人完成，一人捉鼠并固定探頭，另一人操作機(jī)器?；A(chǔ)狀態(tài)下和注射阿霉素后第3、4、5天檢查小鼠，探頭放置于左胸前壁，切取滿意的左室長(zhǎng)軸切面后，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于左室后壁而獲得M型超聲心動(dòng)圖，隨即獲取主動(dòng)脈流速曲線。獲取的超聲圖像傳送至工作站保存，并由2位未參與試驗(yàn)的超聲師行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。選取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，采用美國(guó)超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)推薦方法進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量數(shù)據(jù)包括：舒張末期左室內(nèi)徑（LVEDD）、收縮末期左室內(nèi)徑（LVESD）、心率（HR），左室收縮功能由左室短軸縮短率（FS）和每分鐘輸出量（CO）評(píng)價(jià)。HR由主動(dòng)脈多普勒血流信號(hào)測(cè)量。FS和CO由以下公式 計(jì) 算 ：FS＝（LVEDD － LVESD）/LVEDD；CO＝HR ×（LVEDD3－LVESD3）。

2.2 組織學(xué)檢查

超聲檢查完畢后在第5天處死所有小鼠，取心臟，稱重，取左心室中上1/3切面，10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色。于40×10倍熒光相差倒置顯微鏡下根據(jù)Billingham推薦方法評(píng)價(jià)每只小鼠心肌的病變程度[4]，即根據(jù)心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占所取切面的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)分，隨后取各組評(píng)分的中位數(shù)：0分表示切面未見心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失；1分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面＜5%；1.5分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面5%～15%；2.0分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面16%～25%；2.5分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面26%～35%；3分表示心肌胞漿空泡化和肌纖維喪失占切面＞35%。

2.3 電鏡檢查

取小鼠的左心室游離壁中上1/3心肌標(biāo)本，放置4%戊二醛固定0.5 h，制作成體積約1 mm3的樣本，送電鏡室，用2%四氧化鋨（pH 7.2），雙重固定2 h，梯度丙酮（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15 min；100%丙酮2次，各10 min）脫水，環(huán)氧樹酯包埋，半薄切片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，再行超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色。部分標(biāo)本醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色行透射電鏡觀察[5]。在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞核、線粒體、肌絲及新生的異常結(jié)構(gòu)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

超聲測(cè)量值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用Student T-test，組織學(xué)病理評(píng)分以中位數(shù)表示，與心功能測(cè)量值關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

對(duì)照組均存活，無異常改變，第5天稱得心臟重量為（0.149±0.005）g。給藥組小鼠普遍出現(xiàn)厭食、體質(zhì)量下降、活動(dòng)減少，第4、5天小鼠存活只數(shù)分別為36、30，第5天給藥組小鼠心臟重量為（0.108±0.012）g，有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2 超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果

對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的超聲指標(biāo)均穩(wěn)定。給藥組小鼠HR僅在第1天內(nèi)有微弱升高趨勢(shì)，隨后下降，第3、4、5天均降低，與當(dāng)天對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05或（P＜0.01）。給藥組FS在第3、4、5天呈下降趨勢(shì)，第5天與當(dāng)天對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。給藥組CO在第4天即明顯下降，與當(dāng)天對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；給藥組LVEDD在第5天明顯減少，與當(dāng)天對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。具體結(jié)果見表1（第0天n＝39；給藥組第4天n＝36，第5天n＝30）。

表1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

表1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

與同一天對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group at the same day：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

參數(shù)HR/次·min－1 LVEDD/cm LVESD/cm FS/%CO/mL·min－1對(duì)照組給藥組第0天579±15 0.294±0.014 0.126±0.015 56.7±4.3 13.2±3.0第3天585±11 0.284±0.022 0.123±0.017 56.4±3.6 12.1±3.4第4天581±14 0.286±0.018 0.131±0.022 54.2±4.5 11.3±2.8第5天580±17 0.294±0.013 0.128±0.017 56.5±3.9 12.5±2.5第0天586±23 0.298±0.019 0.128±0.020 57.0±3.9 13.3±2.7第3天567±31＊0.272±0.022 0.126±0.028 54.0±4.5 9.8±3.3第4天529±32＊0.253±0.047 0.126±0.031 50.2±5.6 7.5±2.3＊第5天478±30＊＊0.227±0.051＊＊0.125±0.036 44.3±6.1＊4.7±2.0＊

3.3 HE染色光鏡檢查

對(duì)照組胞漿豐富，肌纖維排列整齊；病理評(píng)分中位數(shù)均為0。給藥組心肌損傷明顯，細(xì)胞內(nèi)空泡形成，肌纖維斷裂、排列紊亂，細(xì)胞間隙水腫；第5天病理評(píng)分中位數(shù)為2.5。各組小鼠心肌細(xì)胞HE染色圖見圖1，給藥組小鼠第5天病理評(píng)分見表2。

3.4 第5天電鏡檢查

對(duì)照組肌絲完整，線粒體未見異常；給藥組可見肌絲排列紊亂，部分肌絲溶解，髓樣結(jié)構(gòu)形成，線粒體腫脹，線粒體嵴模糊。各組小鼠心肌細(xì)胞電鏡檢查圖見圖2。

4 討論

阿霉素通過激活一氧化碳合成酶、結(jié)合三價(jià)鐵和誘生過氧化氫等多種機(jī)制，促使心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。注射20 mg·mL－1阿霉素后第24小時(shí)，即能發(fā)現(xiàn)Tunnel陽性的小鼠心肌凋亡細(xì)胞顯著增多[6]。

本研究進(jìn)一步顯示，一次性腹腔注射20 mg·mL－1阿霉素，能在小鼠上建立穩(wěn)定的非缺血性心肌病模型。組織病理切片示心肌纖維斷裂、胞內(nèi)空泡化，電鏡下見線粒體腫脹、部分肌絲溶解，均屬阿霉素心臟毒性的典型表現(xiàn)[7]。給藥組的第5天心肌Billingham評(píng)分均在1.5分以上，證實(shí)阿霉素的心肌損傷充分、可靠；給藥組的第4、5天小鼠存活數(shù)量足夠接受檢查。給藥組小鼠FS減少，CO及心率下降，符合心功能不全的典型表現(xiàn)，與國(guó)外其它實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果一致[8，9]。

高頻率超聲心動(dòng)圖能監(jiān)測(cè)心肌病小鼠的心功能改變。本研究采用飛利浦公司提供的6～15 MHz線陣探頭，檢查頻率設(shè)定為15 MHz，橫向分辨率和縱向分辨率在理論上可達(dá)0.02、0.001 mm[10]，足以提供清晰的超聲圖象。此外，對(duì)照組在3、4、5 d測(cè)量的數(shù)值皆均勻一致，離散趨勢(shì)??；相應(yīng)給藥組的心功能指標(biāo)隨時(shí)間變化逐漸偏低，符合病程變化，說明高頻率超聲心動(dòng)圖確能有效地評(píng)價(jià)該心肌病模型。

HR、CO、FS與相應(yīng)的心肌病理評(píng)分相關(guān)系數(shù)依次為0.934（P＜0.001）、0.842（P＜0.001）、0.765（P＜0.01）。與CO 和FS比較，HR與組織學(xué)病理評(píng)分之間的相關(guān)系數(shù)最大，測(cè)量值變異系數(shù)最小，可見HR是評(píng)價(jià)心肌病模型的最敏感指標(biāo)，追蹤該模型HR的改變是必不可少的。第5天給藥組各心功能指標(biāo)均顯著下降，電鏡檢查顯示肌纖維內(nèi)出現(xiàn)典型的阿霉素心肌毒性改變，說明給藥后第5天心肌病模型已經(jīng)成功建立。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的小鼠LVEDD減少，與長(zhǎng)時(shí)間阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病表現(xiàn)不符，可能是小鼠心臟重量急劇減輕所致，該結(jié)果與其它實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果一致[8]。

阿霉素短時(shí)間內(nèi)能在小鼠上誘導(dǎo)出心肌病心衰模型，該模型具有經(jīng)濟(jì)、可靠、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，使用高頻率超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)該模型建立成功。

（致謝：本研究部分在香港中文大學(xué)兒科學(xué)系宋銀子教授指導(dǎo)并幫助下完成，特致謝?。?/p>

表2 給藥組小鼠第5天病理評(píng)分（n＝30）Tab 2 Pathologic scores of administration group on the fifth day（n＝30）

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞HE染色圖（10×40）A.對(duì)照組；B.給藥組Fig 1HE staining of myocardium of each grou（p10×40）A.control group；B.administration group

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞電鏡檢查圖（×8 000）A.對(duì)照組；B.給藥組Fig 2 Electron microgram of myocardium of each group（ ×8 000）A.control group；B.administration group

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