張 斌，唐建華，謝洪平

（蘇州大學 醫(yī)學部藥學院，江蘇 蘇州 215123）

石墨烯(Graphene)是碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀（honeycomb）晶格結構的一種炭質新材料［1,2］，碳原子排列與石墨的單原子層一樣.這種石墨晶體薄膜的厚度只有0.335nm，厚度僅為頭發(fā)的20萬分之一，是構建其他維數(shù)炭質材料（如零維富勒烯、一維碳納米管、三維石墨）的基本單元，具有極好的結晶性及電學質量和非凡的電子學、熱力學和力學性能.石墨烯自2004年由英國曼徹斯特大學的Geim等［3］利用膠帶剝離高定向熱裂解石墨的方法獲得后，引起了科學家的廣泛關注和極大的興趣，被預測很有可能在很多領域引起革命性變化.氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，因表面具有羥基、羧基等親水性基團而具有良好的水溶性，同時也便于功能化和應用.已有報道，GO作為抗癌藥物喜樹堿的類似物SN38的載體［4］以及GO結合功能分子卟啉用于Ca2+的快速分析［5］等應用.然而，GO定量結合藥物或各種功能分子的報道還很少.亞甲藍(Methyleneblue，MB)是一種吩噻嗪類染料，化學名為氯化3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓三水合物，結構式為C16H18ClN3S·3H20.臨床上用作氰化物和亞硝酸鹽中毒的解毒劑，也是光化學法滅活新鮮單袋血漿中病毒的光敏劑.在有關吸附劑的吸附特性的表征中，染料也常作為模型吸附質，如吸附劑的吸藍量就是指其對亞甲藍的飽和吸附量.因此亞甲藍為吸附研究中最為常用的模型染料之一［6,7］.

本文采用改進的Hummer法［4］制取氧化石墨烯，然后在蒸餾水中利用超聲分散將氧化石墨剝片得到GO.以MB為模型分子，采用紫外分光光度法考察GO對MB的載藥結合量，為GO結合具有紫外吸收的藥物分子或各種功能分子提供定量方法.

1 實驗

1.1 儀器與試劑

UV-2401紫外-可見全波長掃描儀（日本島津公司），透射電子顯微鏡（BHV-55，日本理研電子公司），TGL-16B高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），KA-1000臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），EL104電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）.

石墨（固定碳含量99.9%，325目，青島恒銳密封制品廠），KMnO4（國藥集團化學試劑有限公司），H2SO4（95.0-98.0%，昆上金城試劑有限公司），H2O2（30.0%，上海聯(lián)試化工試劑有限公司），BaCl2(上?；瘜嶒灦S)，HCl(36.0-38.0%，昆上金城試劑有限公司)，亞甲藍（生物染色劑，上海山浦化工有限公司），PBS緩沖溶液（0.02mol/L，pH7.33），其他試劑均為分析純，實驗用水為三次蒸餾水.

1.2 氧化石墨烯的制備

將1g石墨加入到裝有23ml濃H2SO4的圓底燒瓶中，機械攪拌12小時.低溫條件下緩慢加入6g KMnO4后，將溫度升到40℃反應30分鐘，再將溫度升到90℃反應1.5小時.緩慢連續(xù)加入46ml三蒸水，使溫度上升到98℃，在此溫度下維持25分鐘.然后加入140ml三蒸水和10ml 30%的H2O2，在H2O2作用下，懸浮液變成亮黃色.為了純化氧化石墨，先用5%的HCl反復洗滌，直至無硫酸根離子（用BaCl2溶液檢測），再用三蒸水充分洗滌至近中性.將純化后的氧化石墨超聲2小時，然后離心3000rpm 30分鐘，上層即為GO.

1.3 氧化石墨烯結合亞甲藍

1.3.1 溶液配制

精密稱取MB 0.1160g(約310.2μmol)，置于1000ml的容量瓶中，用PBS緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，配成310.2μmol/L的儲備液，避光、密封保存.

1.3.2 亞甲藍的標準曲線

用MB儲備液和PBS緩沖溶液分別配制含MB 1.85μg/ml、2.31μg/ml、2.75μg/ml、3.24μg/ml、3.70μg/ml的標準溶液，于665nm處測定其吸光度，以吸光度值A對濃度C作圖.

1.3.3 游離亞甲藍的含量測定

將MB儲備液按不同倍數(shù)稀釋，得到一系列不同濃度的MB溶液.將制備的GO（1mg/ml）用PBS緩沖溶液稀釋成含GO 10μg/ml的溶液.將3ml不同濃度的MB溶液（1.93～58μg/ml）與3ml GO溶液（10μg/ml）分別加入8支具塞試管中，室溫振蕩2h，充分混勻.取出后高速離心12000rpm 15 min，以665nm作為檢測波長，測定各上清液的吸光度，平行測定3次，取平均值，由MB的標準曲線計算平衡吸附液中游離的MB含量.

2 結果與討論

2.1 氧化石墨烯的表征

石墨烯的理論研究已有60多年的歷史，被廣泛用來描述不同結構炭質材料的性能.20世紀80年代，科學家們開始認識到石墨烯可以作為(2+1)維量子電動力學的理想模型.但一直以來人們普遍認為這種嚴格的二維晶體結構由于熱力學的不穩(wěn)定性而難以獨立地穩(wěn)定存在.直到2004年，Geim等［3］用一種極為簡單的方法剝離并觀測到了單層石墨烯晶體，才引起了科學界新一輪的“碳”熱潮.同樣，GO也是單層二維晶體.對合成的GO用透射電鏡進行表征，其結果見圖1.從圖1可以看出，GO表面并不平坦，而是有很多起伏和褶皺區(qū)域，正是這些區(qū)域才使得二維晶體能夠穩(wěn)定存在［8］.

圖1 氧化石墨烯的透射電鏡圖

2.2 亞甲藍檢測波長的選擇

由GO與MB的紫外吸收光譜（圖2）可看出，GO在230nm處有最大吸收峰，在300nm處有一個肩峰，這兩個特征吸收峰分別對應芳香環(huán)C-C的π-π*躍遷和C=O的n-π*躍遷［9］.而MB在可見光區(qū)665nm處有強吸收峰，選擇此波長測定其含量具有較高的靈敏度，且GO在此波長處基本無吸收，不會對MB的測定造成干擾，因此選擇665nm作為GO吸附MB后對MB的檢測波長.

圖2 亞甲藍與氧化石墨烯的紫外吸收光譜1.MB（1.85μg/ml）；2.GO（11.76μg/ml）

圖3 亞甲藍濃度與吸光度的關系

2.3 亞甲藍檢測的線性范圍

以665nm處的吸光度值A對亞甲藍濃度C作線性回歸，回歸方程為A=0.2065C-0.05148，相關系數(shù)r=0.9999.結果顯示，亞甲藍濃度在1.85～3.70μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系（見圖3）.

2.4 氧化石墨烯對亞甲藍的載藥性能

氧化石墨烯對亞甲藍的載藥性能用GO對MB的平衡吸附量進行表征，即

其中，MGO為藥物載體GO的質量（g），M0為加入研究體系的MB的量（mg），Mfree為平衡吸收后游離的MB的量(mg)，Qe即為GO對MB的平衡吸附量（即載藥量，mg/g）.其載藥量曲線參見圖4.

圖4 氧化石墨烯對亞甲藍的載藥量

從圖4可知：當亞甲藍的初始濃度C0從0.967μg/ml升高至2.416μg/ml時，載藥量Qe從68.3mg/g升高至169.9mg/g，提高了近2.5倍.說明在亞甲藍濃度較低時，隨濃度C0的升高，氧化石墨烯對MB的載藥量有顯著的提高，這是由于氧化石墨烯具有大量的自由表位可供亞甲藍結合.

而隨著亞甲藍濃度C0的進一步增加，氧化石墨烯表面的自由表位逐漸被亞甲藍占據(jù)，而總的表位是有限的，所以載藥量隨亞甲藍濃度升高而增加的程度逐漸變緩，即圖4中C0在2.416-9.667μg/ml范圍內(nèi)所表征的載藥情況.當亞甲藍濃度從9.667到19.334μg/ml時，載藥量Qe從204.734增加到218.051mg/g，增加量極微，表現(xiàn)出了吸附平臺區(qū).因此，本文認為C0=9.667μg/ml時的吸附量204.734mg/g即為飽和吸附量.

當亞甲藍濃度C0從19.334μg/ml繼續(xù)升高時，吸附量顯著增加，但此時體系中能夠觀察到細微的絮狀沉淀.其原因可能是氧化石墨烯表面電離羧基所帶的負電荷幾乎完全被MB所中和，使溶液中GO保持穩(wěn)定分散的條件被破壞，由GO極大的表面積所導致的團聚作用使其產(chǎn)生絮狀沉淀.團聚顆粒通過非特異性的吸附作用，將溶液中游離的亞甲藍一并沉降下來，使上清液中所測得的亞甲藍含量偏低，造成載藥量出現(xiàn)繼續(xù)上升的結果.該類沉降現(xiàn)象不利于藥物生物利用度的提高，因此，GO對MB的最大載藥量認為是C0=9.667μg/ml時的載藥量204.734mg/g，較通常的藥物載體表現(xiàn)出了一定的載藥優(yōu)勢［10］.

氧化石墨烯對亞甲藍所表現(xiàn)出的較理想的負載量，主要歸因于它具有較大的比表面積，通過氫鍵、π鍵等作用［11］，使染料、藥物等分子結合到氧化石墨烯表面.同時，靜電吸附對此結合過程也有影響，在pH7.33的PBS緩沖環(huán)境下，氧化石墨烯表面豐富的羧基將電離而帶負電荷，而亞甲藍電離成正離子，靜電吸附進一步提高了氧化石墨烯對亞甲藍的結合量.

3 結論

本實驗以GO為載體，MB為模型分子，采用紫外分光光度法考察GO結合MB的含量，靜態(tài)吸附試驗表明GO對MB的最大結合量為204.734mg/g.該研究為GO結合具有紫外吸收的藥物分子或各種功能分子提供了定量方法.

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