許 璞

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

自1862年Thuret報道了紫菜屬海藻Porphyra umbilicalis與P.leucosticta精子囊的觀察結果以來，對于紫菜生殖器官形成及其性別的研究基本上為描述性的.紫菜的性別表現依據分類學描述可基本分為：雌雄同株型，如條斑紫菜（P.yezoensis）；雌雄異株型，如擬線形紫菜（P.pseudolinearies）和狹葉紫菜（P.angusta）；雌雄同株兼有雌雄異株（或雌雄異株兼有雌雄同株）類型，如華北半葉紫菜（P.katadai var.hemiphylla）和壇紫菜（P.haita?nensis）.作為分類學的重要依據，雌雄生殖細胞在藻體上的分布規(guī)律代表紫菜屬物種的特征.在雌雄同株類型中，有的種類分裂為小區(qū)域間生或混生，而有的種類雌雄細胞分別位于同株藻體的兩側或上下兩部分.條斑紫菜精母細胞分裂成熟后形成條帶狀精子囊器區(qū)域，鑲嵌在果孢子囊群中，成為該物種的鮮明特征.然而同為生殖細胞小區(qū)域混生的種類，有的物種精子囊器區(qū)域較小，且較分散.而少精紫菜（P.oligospermatangia）成熟藻體的外型更象全雌個體，雄性細胞分裂區(qū)域極小，精子囊器區(qū)呈很小的點狀出現于果孢子囊群中.半葉紫菜藻體在尚未成熟的時期就可區(qū)分出雌雄區(qū)域，兩性區(qū)域之間有明顯的界線，分生于藻體的兩側.雌雄同株的壇紫菜在早期生長階段難以分辨兩性區(qū)域，當藻體成熟時，果孢子囊群和精子囊器常以直線或曲線區(qū)別，各自分布于藻體的不同區(qū)域.雌雄異株的藻體，生殖細胞多沿藻體的前端和兩側邊緣形成.日本學者對紫菜生殖細胞分布類型做了一個近似的歸納總結：雌雄異株，即藻體只產生單一性別生殖細胞而有雌、雄藻株之分；雌雄同株，同一藻體上發(fā)生雌、雄生殖細胞，但兩性生殖組織區(qū)域分生明顯；雌雄同株，兩性生殖細胞分裂成小區(qū)域間生或混生在一起；雌雄同株，雄性生殖區(qū)域極小或不明顯［1］.

紫菜的性別發(fā)生有什么規(guī)律，為什么會出現如此多樣的性別表現類型，它們是性決定還是性分化？隨著紫菜減數分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)時期的新證據出現［2-4］，遺傳學研究者認為性別遺傳機制可以闡明這一現象.上世紀90年代初，加拿大藻類遺傳學家ven der Meer和他的學生Mitman，對一種生長分布在北美地區(qū)的紫菜P.purpurea開展了性別遺傳及其決定機制的研究，其主要結果包括：P.purpurea減數分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)之時，被突變色素標記的萌發(fā)細胞發(fā)育歷程表明，P.purpurea藻體形成的兩性生殖細胞區(qū)域，起源于殼孢子最初的分裂細胞，一個細胞僅對應于一種性別的細胞組織區(qū)域；P.purpurea藻體兩性生殖區(qū)域分生特征是由減數分裂第一次分裂后，處于頂端位置細胞第二次分裂所作橫向分裂所致，即這一雌雄同株型藻體的性別表現出分界明晰的左右性，是由早期細胞分裂生長模式所決定；對野外生長和實驗培養(yǎng)的藻體所作的性別比例分析，其結果符合1∶1分離規(guī)律［5］.這一研究結果說明，P.purpurea的性別發(fā)生受一對等位基因控制，在殼孢子初始萌發(fā)分裂時，性等位基因隨減數分裂分離，表現兩性的初始細胞在同一個體上各自分別生長發(fā)育，長成雌雄組織的嵌合體，表現為雌雄同株、兩性區(qū)域分生的藻體.

對于P.purpurea性決定機制的研究，是首次對紫菜性別發(fā)生機制的研究工作.由于紫菜屬海藻在性別發(fā)生上的多樣性，僅由性決定機制解釋顯然是不夠的.華北半葉紫菜（P.katadai var.hemiphylla）、少精紫菜（P.oligo?spermatangia）、壇紫菜（P.haitanensis）和條斑紫菜（P.yezoensis）為我國沿海常見紫菜物種，其中壇紫菜和條斑紫菜也是人工栽培利用的種類，屬重要經濟海藻.4種紫菜在生殖器官發(fā)生以及性別表現上有明顯差異［6］，對這些紫菜種類表現的性別特征進行比較研究，有助于認識紫菜屬海藻性別發(fā)生的規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 藻體性別觀察

華北半葉紫菜：每年春季3～4月青島海區(qū)自然發(fā)生群體達到盛期，對數量較大的藻落進行采集，藻體長3～10cm.采集藻體保濕帶回實驗室，逐一記錄檢測結果.

壇紫菜：對不同區(qū)域自然生長和人工栽培生長群體開展多批次取樣，統(tǒng)計樣本數量＞200株/次，每一藻株除外觀檢測外還作鏡檢驗證，以保證統(tǒng)計分析的可靠性.野外取樣開展進一步的實驗培養(yǎng)觀察，包括成熟藻株和未成熟藻株，培養(yǎng)條件：20±1℃，100μmol m-2s-1，14L:10D，10～25d.

條斑紫菜和少精紫菜：每年春季采集青島海區(qū)成熟藻體，條斑紫菜還包括江蘇沿海人工栽培的藻體，采集藻體的檢測結果再由鏡檢逐一確認.

1.2 藻體早期發(fā)育模式和生長特點的觀測

色素突變體誘變獲得方法參照有關文獻［7］.采集突變型絲狀體成熟釋放的殼孢子，玻片水滴培養(yǎng)，顯微鏡觀測記錄.重點觀察比較各物種殼孢子萌發(fā)個體的早期生長特點和色素突變體標記的細胞組織生長發(fā)育過程，研究區(qū)分各物種藻體的發(fā)育特征以及與性別表現的關系.

圖1 華北半葉紫菜性別表現特征

2 結果

2.1 4種紫菜性別表現特征與性比觀測

2.1.1 華北半葉紫菜性別表現特征與性比

華北半葉紫菜在青島沿岸海域春季發(fā)生，3～4月為生長盛期.野外生長的植株數毫米大小就可鏡檢觀察到色澤深淺分明的兩種藻體組織，一般以藻體生長中軸為界，兩側分生.藻體成熟時，色澤較深區(qū)域細胞發(fā)育為果胞和果孢子囊，色澤較淺部分形成精子囊器.其植株雖為雌雄同株，但性別的兩側分生特征明顯（見圖1）.

對2005年、2006年生長盛期采集的所有3cm以上植株進行性別觀察分析，獲得3481株，其中雌雄同株3356株，雌株68株，雄株57株，雌、雄性別比例為1∶0.997（表1）.這一結果表明華北半葉紫菜符合等位性狀分離的數量關系.

2.1.2 壇紫菜性別表現特征與性比

壇紫菜藻體秋季發(fā)生，在主產地福建海域的自然生長群體初冬進入生長盛期，翌年春季衰老流失.人工栽培藻體生長旺盛期較早，閩浙粵海區(qū)稍有差異，一般為10～12月，但生長群體衰老時間也較早于當地的野生群體.壇紫菜藻體進入快速生長期后，不同時期均可采集到成熟植株.成熟植株發(fā)生的生殖細胞多沿藻體前端邊緣分布，充分成熟的藻體前端部充滿雌或雄的生殖器官，并延伸至藻體中、后部位的邊緣區(qū)域.同一植株一般表現一種性別（圖2A），但仍可觀察到雌雄性別同株的藻體，雌雄同株藻體兩性生殖細胞有各自的分布區(qū)域，以曲線、直線或斜線分界（圖2B）.

表1 半葉紫菜自然種群藻體性比觀測

采集2004～2006年不同生長期的藻株材料進行觀察，總數達到6411株，獲得成熟植株5050株，其中表現雌性的植株2455株，雄株2581株，雌雄同株14株，性別比例1∶1.05（表2）.觀察結果顯示，不同批次采集的生長群體性別比例有所差異，但無偏性規(guī)律，隨著觀察樣本的增加，其性別比例接近1∶1數量關系.

2.1.3 壇紫菜性別發(fā)生特點的實驗觀察

在野外采集的觀察材料中，每批都有不同比例的未成熟藻體（表2）.隨機取用部分未成熟藻體（組別1、組別3）進行室內培養(yǎng)，繼續(xù)觀察其性別發(fā)生特點.結果顯示：較短培養(yǎng)時間（11～12d）達到性成熟的藻體不足半數，其中表現雄性性別的植株數明顯多于雌性；經較長時間培養(yǎng)（25d）后，多數藻體可以成熟，雌雄植株比例相等（表3）.這一結果表明，在同一群體內雄性生殖細胞發(fā)生較早，可能影響性別比例的觀察結果，但充分成熟的藻體性比仍然具有1∶1關系，印證了野外生長群體的觀察結果.

圖2 壇紫菜性別表現特征

表2 壇紫菜野外生長藻體性比觀測

表3 壇紫菜野外未成熟藻體實驗培養(yǎng)的性比觀測

繼續(xù)對野外已成熟的藻體進行定株培養(yǎng)觀察（組別1、組別2、組別3、組別4、組別7和組別8），發(fā)現經一段培養(yǎng)時間（11～24d）后，隨著藻株的充分成熟，生殖細胞向藻體中、后部位延伸，或前端部位生殖細胞大量放散離體，兩種性別培養(yǎng)植株都出現表現相反性別性狀的個體，并出現雌雄同株個體.在培養(yǎng)觀察的1818株藻體中，異性生殖組織出現率為2.1%（表4）.

2.1.4 條斑紫菜和少精紫菜性別表現及其特征觀察

條斑紫菜和少精紫菜自然生長藻體均在春季發(fā)生，生長盛期一般為3～4月，少精紫菜旺盛生長期來得略遲.人工栽培的條斑紫菜秋季發(fā)生，11月進入生長盛期，直至翌年4月.兩種紫菜進入快速生長期均可觀察到成熟藻體.成熟的條斑紫菜藻體前端及周緣形成很多條紋狀精子囊區(qū)域，鑲嵌在果胞或果孢子囊區(qū)，成為該物種鮮明的特征；少精紫菜成熟初期不易觀察到雄性生殖細胞，但鏡檢可觀察到小塊的雄性生殖細胞區(qū)域，充分成熟的藻體在果孢子囊區(qū)域中呈現點狀或小塊狀精子囊器區(qū)（圖3）.

兩種紫菜性別表現的共同特征是，無論是殼孢子或單孢子萌發(fā)生成的藻體，從未觀察到單一性別表現的植株，兩性生殖細胞總是在同一植株上發(fā)生，生殖器官形成區(qū)域間生或混生，無性別組織分生現象，性別表現無可量的等位關系.

2.2 4種紫菜藻體早期發(fā)育特點

由突變色素標記的雜合絲狀體（2n）成熟后釋放殼孢子，其萌發(fā)分裂個體顯示遺傳學機制的四分子特點（圖4）.表明紫菜葉狀體是具有四分子性質的特殊生長體，由于殼孢子分裂形成的4個配子生長體不能自由分離，因而其發(fā)生植株是具有雙親背景或不同遺傳性質藻體組織的嵌合體.

在所觀察的4種紫菜物種中，突變色素標記的嵌合體顯示，條斑紫菜、壇紫菜和少精紫菜具直線生長發(fā)育特性；華北半葉紫菜絕大多數初期分裂個體為典型的四分子缺失型，由于其第二次分裂頂端細胞分裂的橫向性，致使生長個體表現出兩側發(fā)育的特性.繼續(xù)培養(yǎng)觀察，可以清晰地看到兩種早期發(fā)育模式對藻體生長及形態(tài)建成的影響作用（圖5）.

表4 壇紫菜野外成熟藻體實驗培養(yǎng)的性比觀測

圖3 條斑紫菜、少精紫菜性別表現特征

圖4 紫菜殼孢子萌發(fā)分裂表現的四分子

圖5 紫菜生長藻體兩種基本發(fā)育模式

2.3 4種紫菜性別表現特征比較

綜合野外調查和實驗觀察結果，4種紫菜的性別表現可由表5概括.經比較表明：在紫菜物種中有兩種基本的性別類型，可由性比等位關系與否加以區(qū)別雌、雄同株性別表現在不同類型的物種中，其表現方式與機制不同，具性比等位關系的物種，生長藻體（華北半葉紫菜和壇紫菜）的性別單獨表達，或以分生組織表達，而兩性生殖細胞間生（混生）的藻體，其物種（條斑紫菜和少精紫菜）性別無性比等位關系.

4種紫菜性別特征比較

3 討論

在我國產的4種紫菜屬海藻中，華北半葉紫菜的性別特征與P.purpurea極為相似［5］.而同具性別等位分離性質的壇紫菜，盡管在一些重要的生物學特征上與華北半葉紫菜、P.purpurea相同，例如有等同的染色體數［8］，但在性別表現上卻有著重要差異，這也是在紫菜屬海藻性別認識中容易混淆的重要問題之一.以P.purpurea為代表物種的性別表現特征是，早期發(fā)育模式具兩側生長性，性別區(qū)域主要由殼孢子減數分裂第二次分裂形成的頂端2細胞發(fā)育而來，其雌、雄性別同株的性質，是由很高的第二次分裂分離頻率決定的［5］.由于這一類型紫菜植株的營養(yǎng)組織可以識別雌雄性別，明晰的組織區(qū)域標記使其生長發(fā)育特點以及性別決定機制被直觀地表現出來.從壇紫菜生長發(fā)育的觀察結果看，其植株發(fā)生主要以線性生長為主，由突變色素標記的生長個體顯示線性四分子特征（圖4）.野生型藻體在生長過程中無營養(yǎng)組織區(qū)域標記可識別，僅以藻體成熟部位特別是藻體前端部分發(fā)生的生殖細胞區(qū)分植株性別，容易在觀察中得到雌雄異株的結果.繼續(xù)生長的藻體，特別是雌雄同株藻體，顯示壇紫菜藻體性別表現有先后的時序，這與其藻體的線性生長特點相關.野外采集生長充分但未成熟藻體、以及已成熟藻體的實驗觀察結果，可以印證這一結論.

條斑紫菜和少精紫菜顯示出與性決定機制不相符合的性別表現特征.從細胞染色體數［8］、無性生殖行為［9］等生物學特征來看，這似乎也表明它們代表的是另一類型的紫菜種類.然而，即使可能同屬性分化的物種，其分化的表現形式也有差異.條斑紫菜兩性生殖細胞區(qū)域作較有規(guī)律的間生分布，而少精紫菜雄性細胞區(qū)域微小，只在雌性生殖細胞群中作點狀或小塊狀分布.生殖細胞區(qū)域的大小，可以由兩性生殖母細胞分化的早晚、分裂次數以及生殖器官的結構與形狀等特征決定，但若兩性生殖母細胞的形成是相同體細胞分裂的結果，其性別分化一定與某種調控規(guī)律有關.

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