侍江春，肖宇雪，俸貴強(qiáng)，蔡甜，陳科偉*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)3(西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400715)

紫菜隸屬于紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜目、紅毛菜科、紫菜屬藻類，條斑紫菜(Pyropiayezoensis)和壇紫菜(Pyropiahaitnensis)是主要的養(yǎng)殖種類[1]。紫菜是東亞(中國、日本、韓國)主要經(jīng)濟(jì)海藻之一[2-3]，中國是主要的紫菜生產(chǎn)國，其中江蘇省為條斑紫菜主要生產(chǎn)區(qū)[1, 4-5]。紫菜富含蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[6-8]，含有25%～50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，干重)的蛋白質(zhì)和25%～40%的碳水化合物[2, 9]。市售干條斑紫菜是一種高蛋白、低脂肪、富含膳食纖維和多種礦物質(zhì)的天然食品[10]，干條斑紫菜經(jīng)烤制即為烤條斑紫菜或海苔，深受消費者喜愛[11]。

色澤是評價條斑紫菜商業(yè)價值的重要指標(biāo)。條斑紫菜中含有豐富的光合色素，主要包括藻膽蛋白和葉綠素[12]。藻膽蛋白是一種高效捕光色素蛋白，由脫輔基蛋白和幾種藻膽素特異性結(jié)合而成，存在于藍(lán)藻、隱藻、紅藻及少數(shù)甲藻中[13]。根據(jù)波長吸收性質(zhì)不同可分為藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、藻紅藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白[14-15]。藻膽蛋白具有抗氧化性、抗炎和抗癌能力[16]，作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、紡織品等領(lǐng)域，作為功能因子應(yīng)用于保健品、藥品、抗氧化劑和抗炎藥物試劑，因較強(qiáng)的熒光特性和較寬的吸收光譜作為熒光探針和光敏劑應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10, 16-18]，具有較高的生物利用價值。

葉綠素為鎂卟啉化合物[19]，普遍存在于高等綠色植物、原核的藍(lán)藻菌和真核的藻類中[20-22]，具有抗菌、消炎、護(hù)肝、防臭、抗氧化、抗誘變等功能[21-22]，尤其在功能性食品、醫(yī)藥、化妝品方面有良好的開發(fā)前景。

目前尚未有文獻(xiàn)報道建立干條斑紫菜和烤條斑紫菜顏色與儀器分析相關(guān)聯(lián)的質(zhì)量評價體系，我國對干條斑紫菜分級參照GB/T 23597—2009標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，紫菜的色澤指標(biāo)僅憑肉眼觀測。為此本研究通過實驗分析紫菜中的藻膽蛋白和葉綠素的含量和組成，用色差儀客觀量化干條斑紫菜和烤條斑紫菜外觀顏色，并與光合色素含量進(jìn)行相關(guān)性分析和逐步回歸分析，建立色澤指標(biāo)同光合色素間的量效關(guān)系，以期為商業(yè)紫菜產(chǎn)品的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

不同等級干條斑紫菜(AAA、A、B、C、D、E級)，萬紫匯紫菜交易平臺，所有紫菜均為江蘇省連云港生產(chǎn)，紫菜分級嚴(yán)格按照萬紫匯專業(yè)平臺定級?？緱l斑紫菜以AAA級干條斑紫菜為原料，分別在180 ℃烤制30～50 s，參考js/zcxh 001—2014《條斑紫菜 干紫菜等級標(biāo)準(zhǔn)》定級為1～5級。液氮，重慶沙坪壩區(qū)雙流液氮經(jīng)營部；N,N-二甲基甲酰胺(N,N’-dimethylformamide, DMF)、MgCO3、醋酸銨、NaH2PO4和Na2HPO4(均為分析純)、甲醇和丙酮(均為色譜純)，重慶市鈦新化工有限公司；葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品，日本wako試劑公司；葉綠素a衍生物標(biāo)準(zhǔn)品，實驗室自制[23]。

1.2 主要儀器及設(shè)備

UltraScan PRO分光測色儀，美國Hunter Lab公司；Depelec TE55ACS嵌入式蒸烤一體機(jī)，德普凱信(浙江)有限公司；SPEX SamplePrep Geno高通量冷凍研磨機(jī)，上海德可納利儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯(北京)科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；磁力攪拌器，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5810離心機(jī)，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司進(jìn)口；UV-1240紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器)，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

不同等級干條斑紫菜和烤條斑紫菜在液氮保護(hù)下，用高通量冷凍研磨機(jī)研磨成粉，過80目篩，-23 ℃密封保藏備用。

1.3.2 顏色測定

采用色差儀對過80目篩的不同等級干條斑紫菜、烤條斑紫菜進(jìn)行顏色測定，得到客觀量化顏色指標(biāo)值L*、a*、b*、c*、h*，其中L*為明亮度，L*值越大，明度越大，感覺越白；a*為紅綠色度，正值為紅方向，負(fù)值為綠方向；b*為黃藍(lán)色度，正值為黃方向，負(fù)值為藍(lán)方向；c*和h*分別為色澤飽和度和色調(diào)角，分別按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

1.3.3 光合色素含量測定

1.3.3.1 藻膽蛋白含量測定

藻膽蛋白的提?。簠⒖嘉墨I(xiàn)[24]的方法，準(zhǔn)確稱取200 mg條斑紫菜粉于50 mL離心管中，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)，700 W超聲處理5 min后，4 ℃磁力攪拌提取2 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液測量。

藻膽蛋白含量的測定：吸取樣品上清液，分別測定其在562、615、652 nm波長處的吸光值。藻膽蛋白含量按公式(3)(4)(5)計算：

(3)

(4)

(5)

式中：ρ(P)，藻藍(lán)蛋白的含量，mg/mL；ρ(AP)，別藻藍(lán)蛋白的含量，mg/mL；ρ(PE)，指藻紅蛋白的含量，mg/mL。

1.3.3.2 葉綠素含量測定

葉綠素的提取和測定采用高效液相色譜進(jìn)行分析[25-26]。DMF用過濾后飽和MgCO3溶液配成90% DMF水溶液，用于提取條斑紫菜中葉綠素。準(zhǔn)確稱取200 mg條斑紫菜粉于50 mL離心管中，加入40 mL提取液，700 W超聲處理5 min后，4 ℃提取過夜，0.22 μm過濾后即可用于高效液相色譜分析。

采用梯度洗脫程序,流動相A∶V(甲醇)∶V(1 mol/L醋酸銨溶液)∶V(水)=8∶1∶1；流動相B∶V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1。流速為1 mL/min，流動相B起始體積分?jǐn)?shù)25%，35 min內(nèi)，流動相B 線性變化至100%，并保持15 min。采用二極管陣列檢測器檢測(350～700 nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和色譜峰吸光性質(zhì)定性定量分析葉綠素a及其衍生物。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

條斑紫菜顏色測定重復(fù)20次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。其余試驗均重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行顯著性差異分析、Pearson相關(guān)分析、逐步回歸方程分析(不同字母表示P<0.05的顯著性差異)，Origin 8.1軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜顏色分析

由圖1可知，不同級別干條斑紫菜和烤條斑紫菜組間組內(nèi)L*、a*、b*、c*、h*值差異顯著(P<0.05)。各顏色指標(biāo)值差異最大的是a*值和h*值，干條斑紫菜為正值，烤條斑紫菜為負(fù)值，表明干條斑紫菜偏紅而烤條斑紫菜偏綠?？緱l斑紫菜相比于干條斑紫菜L*、b*值更大，表明烤條斑紫菜比干條斑紫菜更白、更黃。黃林彬等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高溫可導(dǎo)致條斑紫菜葉狀體顏色不同程度加深，說明烤制對條斑紫菜的外觀顏色產(chǎn)生一定影響，使烤條斑紫菜相較于干條斑紫菜呈現(xiàn)明亮的黃綠色。不同級別干條斑紫菜和烤條斑紫菜L*、a*、b*、c*值均呈現(xiàn)“波動狀”，ARUGA[28]發(fā)現(xiàn)，紫菜品質(zhì)的好壞主要取決于葉狀體的3種主要光合色素(綠色的葉綠素a、藍(lán)色的藻藍(lán)蛋白和紅色的藻紅蛋白)含量的高低，且與它們之間的比例相關(guān)，所以無法用單一色度值表征干條斑紫菜和烤條斑紫菜等級。

a-不同種類條斑紫菜L*值對比圖;b-不同種類條斑紫菜a*值對比圖;c-不同種類條斑紫菜b*值對比圖;d-不同種類條斑紫菜c*值對比圖;e-不同種類條斑紫菜h*對比圖圖1 條斑紫菜各顏色指標(biāo)值Fig.1 Color indexes of Porphyra yezoensis

2.2 光合色素含量分析

葉綠素和藻膽蛋白色素是條斑紫菜中主要的光合色素[12]。由表1可知，干條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a，烤條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白和葉綠素a。不同級別干條斑紫菜別藻藍(lán)蛋白含量差異不顯著，變異系數(shù)最低為14.97%。其余各光合色素含量和總藻膽蛋白含量、總?cè)~綠素、總光合色素含量差異極顯著(P<0.01)，變異系數(shù)均在15%以上。藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a分別為16 202.78～30 706.41、18 370.28～30 528.13和1 330.64～2 846.16 mg/kg。經(jīng)過烤制以后，烤條斑紫菜中藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、葉綠素 a、脫植基葉綠素a、總藻膽蛋白、總?cè)~綠素、總光合色素含量均減少，其藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量為干條斑紫菜的1/5～1/6。高溫操作影響光合色素的穩(wěn)定性，俞麗燕[29]、CHAIKLAHAN等[30]研究發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性易受溫度、pH、光照強(qiáng)度、離子濃度等的影響，高溫也能造成葉綠素 a的降解，使其含量降低[31]。另外程超等[32]在研究葛仙米藻膽蛋白與色度降解動力學(xué)時發(fā)現(xiàn)，葛仙米藻藍(lán)蛋白色素溶液在高溫處理時會有明顯的褪色現(xiàn)象，并且溫度越高褪色越明顯。經(jīng)過烤制后，紫菜中大量藻膽蛋白分解，葉綠素比例增加，從而顯現(xiàn)出綠色或黃綠色[33]，與圖1結(jié)果相一致?？緱l斑紫菜中，葉綠素衍生物含量明顯增多，如C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a、phytyl-purpurin a，表明葉綠素在期間也發(fā)生了脫鎂和氧化反應(yīng)?？緱l斑紫菜各光合色素含量變異系數(shù)均在20%以上，脫植基葉綠素a、葉綠素a甚至達(dá)到50%以上，說明經(jīng)過烤制之后，會增大條斑紫菜之間光合色素含量的差異。

2.3 條斑紫菜顏色與光合色素含量的相關(guān)分析

對6種干條斑紫菜和5種烤條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，然后進(jìn)一步對干條斑紫菜和烤條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)進(jìn)行逐步回歸分析。

2.3.1 干條斑紫菜各光合色素含量之間的相關(guān)分析

干條斑紫菜各光合色素含量間相關(guān)性結(jié)果見表2。光合色素含量中總光合色素含量與其他光合色素含量均呈正相關(guān)，與藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a、總藻膽蛋白、總?cè)~綠素含量顯著正相關(guān)(r=0.604～1.000)，與C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a含量正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著(r=0.196～0.202)；總藻膽蛋白與藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a含量顯著正相關(guān)(r=0.551～0.995)；總?cè)~綠素與藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素 a含量極顯著正相關(guān)(r=0.718～1.000)；C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、焦脫鎂葉綠素a含量之間極顯著正相關(guān)(r=0.805～1.000)?？傇迥懙鞍?、總?cè)~綠素、總光合色素含量與藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a之間相關(guān)性極強(qiáng)，均在0.900以上(P<0.01)，可見各光合色素含量之間都存在著不同程度的相關(guān)性。

2.3.2 烤條斑紫菜各光合色素含量之間的相關(guān)分析

烤條斑紫菜各光合色素含量間相關(guān)性結(jié)果見表3?？偣夂仙睾颗c藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、脫植基葉綠素a、葉綠素a、總藻膽蛋白、總?cè)~綠素含量顯著正相關(guān)(r=0.651～0.994)，與C132-OH 葉綠素a、脫鎂葉綠素a、phytyl-purpurin a含量呈負(fù)相關(guān)，其中與phytyl-purpurin a含量相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為-0.773(P<0.01)。藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白與脫植基葉綠素a、葉綠素 a、總藻膽蛋白、總?cè)~綠素、總光合色素含量均呈正相關(guān),與干條斑紫菜相比，相關(guān)系數(shù)均下降，而別藻藍(lán)蛋白與其相關(guān)系數(shù)卻上升，可能由于烤制之后烤條斑紫菜藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白含量成倍地減少，而別藻藍(lán)蛋白只減少至干條斑紫菜的一半，從而導(dǎo)致相關(guān)系數(shù)上升。盡管如此，除了藻紅蛋白與總?cè)~綠素相關(guān)性不強(qiáng)外(r=0.273)，烤條斑紫菜總藻膽蛋白、總?cè)~綠素、總光合色素含量和藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量極顯著相關(guān)(r=0.602～0.962)，說明藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a依然是烤條斑紫菜3種重要的光合色素。

2.3.3 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)的相關(guān)分析

條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)相關(guān)性結(jié)果見表4。烤條斑紫菜phytyl-purpurin a含量與b*、c*值顯著正相關(guān)(r=0.914，0.906)，說明b*、c*值越大，烤條斑紫菜phytyl-purpurin a含量越多。其余條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)值相關(guān)性不顯著(P<0.05)。但可看出干條斑紫菜a*值與各光合色素含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.493～-0.185)，c*值和h*值與各光合色素含量呈正相關(guān)(r=0.062～0.390，r=0.033～0.714)，表明a*值越小、c*值和h*值越大，干條斑紫菜各光合色素含量越多。干條斑紫菜總藻膽蛋白、總?cè)~綠素、總光合色素含量與L*、a*值呈負(fù)相關(guān)，與b*、c*值和h*值呈正相關(guān)，而烤條斑紫菜總藻膽蛋白、總?cè)~綠素、總光合色素含量與L*、a*、b*和c*值呈負(fù)相關(guān)，與h*值呈正相關(guān)，可能因為烤制之后烤條斑紫菜呈黃綠色，藻藍(lán)蛋白含量成倍減少，使其與b*值的相關(guān)性增強(qiáng)。綜合分析，干條斑紫菜和烤條斑紫菜L*、a*值越小，h*值越大，總藻膽蛋白、總?cè)~綠素和總光合色素含量越多。

表2 不同級別干條斑紫菜光合色素含量之間的相關(guān)性Table 2 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of dried laver

表3 不同級別烤條斑紫菜光合色素含量之間的相關(guān)性Table 3 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of roasted laver

表4 色度值與光合色素含量之間的相關(guān)性Table 4 Correlation between chroma value and photosynthetic pigment content

2.3.4 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)的回歸分析

根據(jù)干條斑紫菜、烤條斑紫菜各光合色素含量與其顏色指標(biāo)的相關(guān)性分析可知，各光合色素含量與顏色指標(biāo)值存在一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步了解各光合色素含量與顏色指標(biāo)值間的關(guān)系，以各光合色素含量為因變量(Y)，顏色指標(biāo)值為自變量(X)，進(jìn)行逐步多元線性回歸分析。

如表5所示，通過逐步回歸分析后，模型中各光合色素含量預(yù)測值與實際值的相關(guān)系數(shù)與表4中每種光合色素含量與顏色指標(biāo)值單獨的相關(guān)系數(shù)相比，均有不同程度的提高。這說明經(jīng)逐步回歸分析舍去相關(guān)性差的指標(biāo)后，可提高光合色素含量預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。單自變量的預(yù)測模型沒有提高相關(guān)系數(shù)。干條斑紫菜別藻藍(lán)蛋白含量預(yù)測值與實際值的相關(guān)系數(shù)較低，可能因為別藻藍(lán)蛋白僅與單一顏色指標(biāo)存在相關(guān)性且相關(guān)系數(shù)較低。

表5 條斑紫菜各光合色素含量與顏色指標(biāo)回歸分析Table 5 Regression analysis of photosynthetic pigment content and color index of P.yezoensis

干條斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的預(yù)測焦脫鎂葉綠素a含量(Y8)，其回歸方程如表5所示，所建立的模型在99.9%的程度上，可以通過L*值和h*值反映干條斑紫菜中焦脫鎂葉綠素a含量?？緱l斑紫菜L*(X1)、a*(X2)和b*值(X3)可以很好的預(yù)測藻藍(lán)蛋白(Y1)和總藻膽蛋白含量(Y10)，所建立的模型對其解釋概率都為100%，擬合程度非常完美?？緱l斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的預(yù)測別藻藍(lán)蛋白含量(Y3)，b*(X3)、c*(X4)、h*值(X5)可以很好的預(yù)測phytyl-purpurin a含量(Y9)，所建立的模型對其解釋概率分別為95%和100%(P<0.05)。由上可知，干條斑紫菜的焦脫鎂葉綠素a含量和烤條斑紫菜藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、phytyl-purpurin a、總藻膽蛋白含量可以通過顏色值反映，而總光合色素以及條斑紫菜中3種主要的光合色素(藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a)與顏色值建立的模型沒有顯著意義。為了進(jìn)一步探究總光合色素含量和藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a含量間的關(guān)系，以總光合色素含量為因變量(y)，藻藍(lán)蛋白(x1)、藻紅蛋白(x2)、葉綠素a含量(x3)為自變量，進(jìn)行逐步多元回歸分析。干條斑紫菜總光合色素含量y1=10 445.04+1.96x1(R2=0.992，P=0.000)，烤條斑紫菜總光合色素含量y2=1 429.94+2.5x1(R2=0.971，P=0.002)，說明干條斑紫菜和烤條斑紫菜藻藍(lán)蛋白含量可以很好地預(yù)測總光合色素含量，為快速估計條斑紫菜中總光合色素含量提供參考。

3 結(jié)論

條斑紫菜色澤是紫菜光合色素含量和品質(zhì)優(yōu)劣的“指示劑”，且條斑紫菜光合色素在人體內(nèi)具有重要的保健功能[34]。本文通過對6種干條斑紫菜和5種烤條斑紫菜進(jìn)行光合色素含量及顏色測定，通過干條斑紫菜和烤條斑紫菜光合色素含量與顏色指標(biāo)的相關(guān)性分析，可以得出以下結(jié)論：干條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a，烤條斑紫菜光合色素含量大小依次為藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白和葉綠素 a。經(jīng)過烤制之后的藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素a含量為干條斑紫菜的1/5～1/6。干條斑紫菜和烤條斑紫菜各光合色素含量之間均有不同程度的相關(guān)性(|r|=0.037～1.000，|r|=0.041～0.994)，光合色素含量與顏色指標(biāo)存在相關(guān)性，但相關(guān)性不強(qiáng)(|r|=0.033～0.994，|r|=0.034～0.914)。進(jìn)一步以逐步回歸分析建立各光合色素含量的預(yù)測模型可提高光合色素含量預(yù)測值與實際值間的相關(guān)性，從而提高顏色指標(biāo)反映條斑紫菜品質(zhì)的準(zhǔn)確性。但顏色指標(biāo)對預(yù)測干條斑紫菜焦脫鎂葉綠素a含量、烤條斑紫菜藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、phytyl-purpurin a和總藻膽蛋白含量較為顯著，對總光合色素含量及3種主要的光合色素含量不顯著。為此建立干條斑紫菜和烤條斑紫菜總光合色素含量與藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素 a含量的逐步多元回歸方程，結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白含量可以很好的預(yù)測條斑紫菜總光合色素含量。