郭壯，吳璞穎，趙楠，張振東，侯強(qiáng)川*

1(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng)，441053)2(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都，610066)

安康地區(qū)的酸菜又稱(chēng)“漿水酸菜”，以當(dāng)?shù)靥赜屑t皮蘿卜(RedRaphanussativus)纓為主料，輔以小蔥或韭菜發(fā)酵而成。發(fā)酵不僅有效延長(zhǎng)了蔬菜的食用期，更賦予了泡菜與所使用原料完全不同的獨(dú)特風(fēng)味[1]，期間微生物的代謝活動(dòng)是泡菜風(fēng)味品質(zhì)形成的最為重要因素[2]。近年來(lái)，研究人員系統(tǒng)解析了四川[3]、山西[4]和東北地區(qū)[5]泡菜的微生物類(lèi)群，證實(shí)乳酸菌是泡菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌。研究顯示，地理距離越遠(yuǎn)、環(huán)境差異越大，不同地區(qū)發(fā)酵食品的微生物類(lèi)群構(gòu)成差異亦越大[6]。特殊的地理環(huán)境和原料是否賦予了安康地區(qū)泡菜較為獨(dú)特的微生物類(lèi)群，值得進(jìn)一步研究。

作為仿生學(xué)技術(shù)，電子舌和電子鼻對(duì)一類(lèi)味覺(jué)或嗅覺(jué)化合物具有整體選擇性，體現(xiàn)了各化合物之間相互作用的特性，在食品品質(zhì)評(píng)價(jià)方面具有一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。研究人員對(duì)泡菜中的微生物類(lèi)群進(jìn)行解析的根本目的之一在于探討泡菜風(fēng)味形成的機(jī)制，進(jìn)而尋求提升泡菜品質(zhì)的途徑[9]。目前針對(duì)乳酸菌對(duì)泡菜風(fēng)味影響的研究較多，但更多的局限于乳酸菌單菌種發(fā)酵，而對(duì)于微生物類(lèi)群或多株菌相互作用對(duì)泡菜品質(zhì)影響的研究報(bào)道尚少[10]。較之純培養(yǎng)技術(shù)和指紋圖譜技術(shù)，以MiSeq為代表的第二代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)發(fā)酵食品微生物類(lèi)群更為全面和系統(tǒng)地解析[11]，使探討微生物類(lèi)群與泡菜品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究成為可能。

本研究首先使用電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)安康地區(qū)泡菜水品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，繼而采用MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)泡菜水中微生物類(lèi)群進(jìn)行解析，最后基于Procrustes分析對(duì)泡菜水品質(zhì)和細(xì)菌多樣性的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，以期為我國(guó)特色泡菜制品微生物類(lèi)群的揭示和產(chǎn)品品質(zhì)特征形成原因，提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、FastPfu Buffer，北京全式金生物技術(shù)有限公司；參比溶液、極性溶液、味覺(jué)標(biāo)準(zhǔn)溶液，日本INSENT公司；NaCl，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；MiSeq高通量測(cè)序配套試劑，美國(guó)Illumina公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SA 402B電子舌，日本INSENT公司；PEN3電子鼻，德國(guó)AIRSENSE公司；TGL-16M 冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)ProteinSimple公司；Veriti FAST梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司；R920型機(jī)架式服務(wù)器，美國(guó)DELL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

于2019年12月上旬從陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣(E109°52′，N31°88′)和嵐皋縣(E108°9′，32°32′)的農(nóng)戶(hù)家中采集泡菜水14 份，編號(hào)為AK1～AK14，泡菜制作時(shí)間為2019年10月下旬—11月中旬，均使用老鹵作為“引子”，原料均為紅皮蘿卜纓，少部分樣品添加了韭菜和蔥等輔料用于提味，泡菜水均為鮮亮的酒紅色。樣品采集時(shí)，首先使用長(zhǎng)柄湯勺在泡菜壇中攪拌2 min，繼而從上層舀取約200 mL泡菜水于500 mL樣品瓶中。樣品瓶置于含有冰袋的采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，途中每隔6 h左右擰開(kāi)瓶蓋排放樣品產(chǎn)生的氣體。

1.3.2 基于電子舌技術(shù)泡菜水滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

量取50 mL泡菜水和50 mL蒸餾水混合均勻后于8 000 r/min離心10 min，取上清液于電子舌測(cè)試杯中，參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行分析。

1.3.3 基于電子鼻技術(shù)泡菜水風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

量取15 mL泡菜水于8 000 r/min離心10 min，取上清液于配套樣品瓶中，樣品瓶置于60 ℃的水浴鍋中保溫30 min，并于室溫平衡10 min后上機(jī)測(cè)試。參照倪慧等[13]對(duì)泡蘿卜水的測(cè)試參數(shù)進(jìn)行分析，每份樣本平行測(cè)試3 次，選取59、60和61 s時(shí)的響應(yīng)值為測(cè)試值進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.4 微生物宏基因組DNA提取和擴(kuò)增

吸取20 mL泡菜水，于400 r/min離心10 min，取上清液，于8 000 r/min離心10 min取菌泥，使用基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，參照折米娜等[14]方法對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(v1.70)平臺(tái)對(duì)質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units, OTU)劃分、分類(lèi)學(xué)地位注釋、α多樣性分析和β多樣性分析[15]，主要流程參照YANG等[16]對(duì)干酪中細(xì)菌多樣性的研究。所有測(cè)序數(shù)據(jù)均已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為mgp93 238。

1.3.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用皮爾森相關(guān)性分析對(duì)平均相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬和品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行研究；選取相關(guān)系數(shù)>0.4或<-0.4，且校正后P<0.05的品質(zhì)指標(biāo)，采用Cytoscape軟件(v3.5.1)進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖繪制；使用Procrustes分析對(duì)泡菜水菌群和品質(zhì)進(jìn)行共變化分析。其他繪圖使用R軟件和Origin 2019b軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜水滋味和風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

泡菜水各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的箱型圖如圖1所示。

圖1 泡菜水滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度值的箱形圖(n=14)Fig.1 Relative intensity of taste indexes in Paocai brine display by box chart注:后味A，澀的回味；后味B，苦的回味;豐度，鮮的回味

由圖1可知，泡菜水的滋味品質(zhì)之間存在較大的差異，酸味、澀味、咸味、鮮味、后味A和豐度的極差值均>1，其中酸味的組內(nèi)差異最大?；陔娮颖羌夹g(shù)，泡菜水風(fēng)味指標(biāo)強(qiáng)度表如表1所示。

表1 泡菜水風(fēng)味指標(biāo)強(qiáng)度表(n=14)Table 1 Relative intensity of flavor indexes in Paocai water

由表1可知，所有泡菜水的各風(fēng)味指標(biāo)之間均存在著較大的差異，響應(yīng)值差異較大的傳感器分別為W1C、W5S和W2S，差異系數(shù)分別為40.55%、40.47%和35.65%。由此說(shuō)明，不同樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異主要在芳香類(lèi)物質(zhì)、氮氧化物和乙醇上。

2.2 泡菜水物種構(gòu)成及多樣性分析

進(jìn)一步采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)泡菜水中細(xì)菌構(gòu)成和功能進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)泡菜水中細(xì)菌隸屬于23 個(gè)門(mén)，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)(平均相對(duì)含量>1.0%)相對(duì)含量的比較分析如圖2所示。

圖2 基于門(mén)水平泡菜水細(xì)菌類(lèi)群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of bacterial structure in paocai brine at the phylum level

由圖2可知，F(xiàn)irmicutes(硬壁菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))和Actinobacteria(放線(xiàn)菌門(mén))為3 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，其平均相對(duì)含量分別為90.19%、7.95%和1.01%，大部分泡菜水中變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)含量極低，僅AK11和AK14中存在較多的變形菌門(mén)。泡菜水中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬(相對(duì)含量>1.0%)相對(duì)含量比較分析如圖3所示。

圖3 基于屬水平泡菜水細(xì)菌類(lèi)群的比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial structure in Paocai brine at the genus level

由圖3可知，泡菜水中共發(fā)現(xiàn)284 個(gè)細(xì)菌屬，Pediococcus(片球菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)為優(yōu)勢(shì)菌屬，平均相對(duì)含量分別為55.53%、29.83%和4.27%。AK1、AK2、AK7、AK8、AK9、AK12和AK13均以Pediococcus為主；AK3、AK4、和AK10均以L(fǎng)actobacillus為主；AK5、AK6和AK11以Pediococcus和Lactobacillus為主，其比例接近1∶1；而AK14則以Pediococcus和Pediococcus為主，其比例亦接近1∶1。由此可見(jiàn)，雖然不同樣品間優(yōu)勢(shì)菌群的類(lèi)群相同，但其含量存在明顯差異。

2.3 菌群與泡菜水品質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析

為了探究菌群對(duì)于泡菜水品質(zhì)的影響，本研究采用Procrustes分析方法，對(duì)泡菜水中菌群和品質(zhì)之間的共變化趨勢(shì)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于Procrustes分析菌群結(jié)構(gòu)和品質(zhì)的共變化趨勢(shì)Fig.4 Covariant trend of microbial structure and quality of Paocai brine based on procrustes analysis

由圖4可知，基于菌群結(jié)構(gòu)和品質(zhì)結(jié)構(gòu)的同一泡菜水樣品在空間排布上呈現(xiàn)一定的相似性，經(jīng)Procrustes轉(zhuǎn)換和顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性非常顯著(P=0.001)。由此說(shuō)明，泡菜水中的菌群群系對(duì)泡菜水的品質(zhì)形成具有顯著的影響。為進(jìn)一步探究菌群對(duì)泡菜水品質(zhì)的影響，本研究對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬與泡菜水品質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖5所示。

圖5 泡菜水優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network diagram of the correlations among dominant bacterial genera and sensory indicators in Paocai brine注：實(shí)線(xiàn)表示正相關(guān)，虛線(xiàn)表示負(fù)相關(guān)；線(xiàn)的粗細(xì)表述相關(guān)性的大小

由圖5可知，乳桿菌屬與3 個(gè)對(duì)芳香型化合物敏感的傳感器響應(yīng)值均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與對(duì)有機(jī)硫化物、氮氧化物和乙醇等化合物敏感的傳感器響應(yīng)值呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，片球菌屬則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)；假單胞菌屬僅與酸味指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。由此可見(jiàn)，乳酸桿菌的群系構(gòu)成對(duì)泡菜品質(zhì)的形成具有重要作用。

3 結(jié)論與討論

本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)Firmicutes為安康地區(qū)泡菜水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，與以往研究結(jié)論相同[17]。亦發(fā)現(xiàn)Pediococcus、Lactobacillus和Pseudomonas為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，累計(jì)平均相對(duì)含量高達(dá)近90%。前期針對(duì)不同地區(qū)微生物優(yōu)勢(shì)群系研究的報(bào)道與本研究存在一定的差異，JEONG等[18]和KIM等[19]研究表明，Lactobacillus、Weissella(明串珠菌屬)和Leuconostoc(腸球菌屬)為韓國(guó)泡菜(Kimchi)中的優(yōu)勢(shì)菌屬；CAO等[20]研究表明Lactobacillus和Pediococcus在四川地區(qū)泡菜中占主導(dǎo)地位，ZHAO等[21]對(duì)四川地區(qū)泡菜研究表明除Lactobacillus和Pediococcus外，還存在Leuconotoc和Lactococcus(乳球菌屬)；李欣蔚等[22]對(duì)東北地區(qū)泡菜研究表明Lactobacillus、Pediococcus和Pseudomonas為其優(yōu)勢(shì)菌屬，同時(shí)存在Wohlfahrtiimonas(污蠅解殼桿菌屬)細(xì)菌。造成差異的原因可能在于泡菜中的微生物群系受制作地環(huán)境、制作工藝、原料、溫度、鹽濃度和酸度等諸多因素的影響[23]。

各地在制作泡菜時(shí)均偏愛(ài)使用老鹵作為“引子”，長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)使用的老鹵可以賦予泡菜更好的感官品質(zhì)，原因在于老鹵中含有較高含量的乳酸菌菌群，循環(huán)使用時(shí)間越長(zhǎng)鹵水中細(xì)菌多樣性越低，但耐酸的Lactobacillus含量反而越高[20]。本研究采用Procrustes分析發(fā)現(xiàn)泡菜水中的菌群群系與泡菜水品質(zhì)具有共變化趨勢(shì)，同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果表明,Lactobacillus與泡菜水中芳香性揮發(fā)物質(zhì)含量呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，Lactobacillus對(duì)安康地區(qū)泡菜水品質(zhì)的形成和提升具有積極的作用。

本研究推斷安康地區(qū)泡菜水中可能存在較為獨(dú)特的細(xì)菌乃至乳酸菌類(lèi)群，在對(duì)安康地區(qū)泡菜水中乳酸菌資源進(jìn)行收集、鑒定和保藏的基礎(chǔ)上，采用全基因組測(cè)序?qū)哂袃?yōu)良發(fā)酵特性乳酸菌菌株的功能特征和發(fā)酵特性進(jìn)行解析[24]，無(wú)論是對(duì)泡菜微生物群系和遺傳多樣性等理論研究，還是對(duì)泡菜品質(zhì)的提升均具有積極意義。在后續(xù)研究中從四川省、重慶市及東北地區(qū)采集更多的泡菜水樣品，使用MiSeq測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)多地區(qū)來(lái)源樣品細(xì)菌類(lèi)群的全面、平行分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中核心細(xì)菌類(lèi)群的甄別，對(duì)安康地區(qū)泡菜水中可能存在較為獨(dú)特的細(xì)菌乃至乳酸菌類(lèi)群這一推論的驗(yàn)證具有積極意義。不可否認(rèn)，由于MiSeq測(cè)序技術(shù)僅針對(duì)細(xì)菌16S rRNA的某一個(gè)或幾個(gè)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，故在解析微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)為保證結(jié)果的可靠性，一般僅在分類(lèi)學(xué)地位“屬水平”上展開(kāi)分析討論，且更關(guān)注相對(duì)含量>1.0%的微生物類(lèi)群[25]，加之納入本研究的樣品僅采集自安康地區(qū)，因而使得本研究存在一定的局限性。后續(xù)研究中采用在測(cè)序讀長(zhǎng)方面具有天然優(yōu)勢(shì)的PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)或使用宏基因組學(xué)測(cè)序手段在分類(lèi)學(xué)地位“種水平”進(jìn)一步對(duì)泡菜水中細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行解析亦極為必要。