尹明雨，劉啟軍，張宗毅，唐史杰，松岡亮輔，奚印慈，王錫昌*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海,201306) 2(上海海洋大學(xué),食品科學(xué)技術(shù)研究室，上海,201306)

磷脂是生物體膜和細(xì)胞膜中的主要成分，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)出與代謝物的排泄等生理過(guò)程起著至關(guān)重要的作用[1]。磷脂在促進(jìn)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、提高大腦活力、延緩機(jī)體衰老、防止血管硬化和抗血栓等方面都有顯著作用，故其被譽(yù)為“腦金”、“血管清道夫”[2]。卵磷脂還可以強(qiáng)化膽汁膽固醇的排泄，參與調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的轉(zhuǎn)錄因子和酶的表達(dá)及活性，其具有特殊的溶解性，可將血管壁上黏連的總膽固醇乳化成微粒，進(jìn)而機(jī)體或者組織將膽固醇乳化成更容易分解的微粒[3-4]。

磷脂進(jìn)入生物體之后，可以經(jīng)各種磷脂酶作用水解成甘油、脂肪酸、磷酸和各種氨基醇等[5]。大量研究表明磷脂酰膽堿具有興奮大腦神經(jīng)細(xì)胞、強(qiáng)化大腦神經(jīng)突觸迅速發(fā)達(dá)的效能，且對(duì)于改善認(rèn)知功能障礙方面有顯著的作用。SHI等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)海洋磷脂能夠顯著改善由順鉑、萬(wàn)古霉素引起的腎毒性，降低線(xiàn)粒體損傷以及細(xì)胞凋亡情況。目前大量的研究工作集中在磷脂生物活性以及乳化特性等方面，但是關(guān)于磷脂進(jìn)入生物體后的對(duì)創(chuàng)傷性失血引起的應(yīng)激性高血糖與糖脂代謝紊亂影響的研究相對(duì)較少。

因此，本研究通過(guò)構(gòu)建失血?jiǎng)?chuàng)傷模型，分析并比較蛋黃磷脂(egg yolk phospholipid，EPLs)和大豆磷脂(soybean phospholipid，SPLs)在24 h斷續(xù)采血過(guò)程調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝特點(diǎn)，進(jìn)一步比較EPLs與SPLs消化吸收特性以及兩者之間的差異。本研究可為后續(xù)磷脂類(lèi)保健品以及生物活性探究實(shí)驗(yàn)提供重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為磷脂代謝功能特性的進(jìn)一步揭示提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

蛋黃卵磷脂(EPLs),日本丘比株式會(huì)社；大豆卵磷脂(SPLs),日本富士和光株式會(huì)社；酪蛋白、β-玉米淀粉、纖維素、混合礦物質(zhì)、混合維生素，日本Oriental酵母工業(yè)株式會(huì)社；蔗糖，日本和田制糖株式會(huì)社；玉米油，日本J-Oil Mills株式會(huì)社。

主要試劑：37 種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、十九烷酸及十九烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜科技股份有限公司；正己烷、三氟化硼-甲醇，色譜級(jí)；三氯甲烷、甲醇、MgCl2、NaOH、、硼酸、鹽酸、濃H2SO4、石油醚(30～60 ℃)等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

15只SD大鼠(3周齡、雄性、45～55 g、SPF級(jí))，上海捷斯捷生物有限公司。將大鼠分別單獨(dú)飼養(yǎng)于塑料籠具中，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(23±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%、明暗周期12 h(明期為8∶00 AM～8∶00 PM)。飼料及水均為自由攝取，籠具及墊料定期清洗更換，適應(yīng)性喂養(yǎng)6周。

1.3 儀器與設(shè)備

H01-B電子天平，北京和田興業(yè)儀器有限公司；RACE GC ULTRA氣相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó) IKA集團(tuán)；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠(chǎng)；DW-40L508超低溫冰箱、4 ℃冰箱，艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀有限公司。

1.4 磷脂脂肪酸

總脂的提?。悍謩e稱(chēng)取EPLs和SPLs 0.5 g于燒杯中，按FOLCH 等[8]提取方法得到總脂。脂肪酸組成分析[9]：稱(chēng)取提取的脂肪0.1 g(精確到0.001 g)，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液和100 μL 10 mg/mL 十九烷酸內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，輕輕振搖溶解，混合均勻。接入冷凝回流裝置，打開(kāi)冷凝水，在100 ℃水浴中煮沸冷凝回流振搖10 min，直至燒瓶?jī)?nèi)油滴消失；再加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，100 ℃冷凝回流5 min；加入2 mL 正己烷，100 ℃冷凝回流2 min；然后將燒瓶從水浴中取出，關(guān)掉冷凝水，待冷凝管中無(wú)液滴滴下時(shí)取下冷凝回流裝置，迅速加入10 mL 飽和NaCl 溶液，充分振蕩，分層澄清后吸取上清液，用0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶，待氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent SP-2560 毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm,0.2 μm)，升溫程序起始70 ℃，以50 ℃/min 升至140 ℃保持1 min，4 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，3 ℃/min 升至225 ℃，保持30 min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；進(jìn)樣量1 μL，分流比45∶1，柱流量1 mL/min，載氣為N2。

定性定量分析：采用37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品與樣品對(duì)比保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，內(nèi)標(biāo)法定量分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)

15只雄性 SD 大鼠使用商業(yè)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)6周，將其隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、卵黃組、大豆組，每組5只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照油重比(1 g/kg)進(jìn)行灌胃:對(duì)照組灌胃玉米油，卵黃組灌胃80%玉米油+20% EPLs，大豆組灌胃玉米油80%+20% SPLs。

灌胃前進(jìn)行體重稱(chēng)量和尾部采血，之后1、2、4、6、12和24 h再次進(jìn)行采血稱(chēng)重。每次采血后都對(duì)采血處進(jìn)行消毒處理。實(shí)驗(yàn)具體步驟見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Experimental schematic

1.6 SD大鼠喝水量與體質(zhì)量的測(cè)定

試驗(yàn)期間觀察大鼠的進(jìn)食、排泄以及活動(dòng)狀況，每次采血前稱(chēng)量1次體質(zhì)量和鼠喝水瓶質(zhì)量并記錄。

1.7 SD大鼠血糖水平測(cè)定

每次采完血，取1滴血樣滴入血糖儀測(cè)定鼠血糖情況，待儀器數(shù)值穩(wěn)定后，讀取數(shù)值并記錄。

1.8 SD大鼠血清中磷脂水平測(cè)定

大鼠尾部取血，采得血液于1.5 mL離心管靜置30 min后，采用4 ℃，1 500×g離心15 min，取上清液于-80 ℃留存待測(cè)。使用鼠用磷脂含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中磷脂含量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用ANOVA分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的多重比較采用Duncan法，不符合正態(tài)分布的采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P<0.05，差異顯著。作圖采用軟件Prism 6.0軟件(GraphPad)繪制，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂主要脂肪酸組成

EPLs與SPLs為動(dòng)物源與植物源磷脂典型代表。研究表明，膳食n-3多不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)可以改善神經(jīng)元發(fā)育，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂等生理活性[10]。由表1可知，2種磷脂脂肪酸組成成分較相似，但EPLs所含脂肪酸種類(lèi)更為豐富，并且具有特殊功能活性的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。EPLs中C16∶0、C18∶0 和C18∶1 N9C的含量顯著高于SPLs(P<0.05)。C18∶2 N6C在SPLs中的含量極顯著高于EPLs(P<0.01)。大量關(guān)于動(dòng)物源磷脂成分檢測(cè)結(jié)果與本文結(jié)果相似，CHE等[11]發(fā)現(xiàn)海參與魷魚(yú)卵的磷脂脂肪酸中PUFA含量與改善認(rèn)知能力和對(duì)腎臟毒性存在關(guān)聯(lián)。WEN 等[12]研究結(jié)果表明，磷脂能夠通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡與線(xiàn)粒體損傷改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。周盛敏等[13]發(fā)現(xiàn)不飽和中鏈脂肪酸可以通過(guò)上調(diào)肝臟內(nèi)基因蛋白過(guò)氧化物酶體增殖物，激活受體α和長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶表達(dá)，從而有效降低小鼠的體重,改善小鼠的脂質(zhì)代謝和肝臟甘油三酯水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝狀態(tài)。EPLs和SPLs中不飽和脂肪酸豐富，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂得潛能,與血糖與磷脂代謝關(guān)系密切。

表1 蛋黃磷脂和大豆磷脂主要脂肪酸組成 單位：mg/g

2.2 體質(zhì)量變化情況

由圖2可知，在24 h的采血實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，體質(zhì)量逐漸降低。在0～6 h間斷采血過(guò)程中，對(duì)照組體質(zhì)量下降速度最大，卵黃組體質(zhì)量下降速度最低?？梢?jiàn)磷脂干預(yù)具有改善體重下降的趨勢(shì)。24 h，卵黃組體質(zhì)量(418.9±6.7)g顯著高于對(duì)照組(410.6±27.1)g和大豆組(410.5±27.1)g。EPLs改善體質(zhì)量變化能力優(yōu)于SPLs。多次采血使SD大鼠出現(xiàn)口干乏力、食欲不振等癥狀，這種結(jié)果使體質(zhì)量快速下降，補(bǔ)充磷脂后，可能是磷脂消化代謝促進(jìn)能量的代謝，刺激機(jī)體能量的補(bǔ)充，也可能磷脂作為一種膳食油脂激發(fā)大鼠的食欲。DALMAZZO等[14]研究結(jié)果表明，由高脂飲食帶來(lái)的體質(zhì)量快速增長(zhǎng)中，EPLs效果優(yōu)于SPLs，本文結(jié)果與其較為一致。

圖2 SD大鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Change of body mass SD rats

2.3 喝水量變化情況

由圖3可知，隨著采血次數(shù)的增加，刺激機(jī)體對(duì)水的攝入。喝水總量的總體趨勢(shì)是增加的，0～4 h期間，EPLs補(bǔ)充提高機(jī)體飲水量，SPLs也有相同趨勢(shì)。對(duì)照組在0～6 h內(nèi)飲水量顯著下降，由此可知，磷脂干預(yù)能夠改善機(jī)體由失血引起得體液缺失，刺激機(jī)體飲水。6 h后，對(duì)照組喝水量增速顯著高于卵黃組和大豆組(P<0.05)。但喝水不能解決根本性的問(wèn)題，要補(bǔ)充血容量、輸血補(bǔ)液[15]，即補(bǔ)充電解質(zhì)、維持外周循環(huán)血量。后續(xù)血容量與電解質(zhì)研究也非常值得關(guān)注。

2.4 血糖變化情況

血糖來(lái)源主要有2種：食物中的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和脂肪；自身存儲(chǔ)的肝糖原和肌糖原[16]。機(jī)體失血后大多處于紊亂的糖脂代謝狀態(tài)，首先由于創(chuàng)傷所導(dǎo)致機(jī)體代謝狀態(tài)增加，以盡快修復(fù)損傷，恢復(fù)正常狀態(tài)。另一方面又會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激性的血糖紊亂狀態(tài)，使能量代謝過(guò)程存在障礙[17-18]。應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體血糖會(huì)大量分解提供熱量和功能。

由圖4可知，對(duì)照組血糖在整個(gè)過(guò)程中呈現(xiàn)先降低再升高最后恢復(fù)平穩(wěn)的趨勢(shì)，卵黃組與之相似。大豆組血糖含量先升高再降低最后恢復(fù)平穩(wěn)(P<0.05)。卵黃組血糖恢復(fù)平穩(wěn)時(shí)間最短，EPLs對(duì)于由創(chuàng)傷引起的應(yīng)激高血糖狀態(tài)具有良好的平復(fù)作用，SPLs沒(méi)有顯著效果。機(jī)體受到創(chuàng)傷后，可能是由于磷脂參與脂質(zhì)代謝部分轉(zhuǎn)化成血糖，避免血糖含量異常變化，造成機(jī)體代謝異常紊亂。

2.5 磷脂變化情況

人體出現(xiàn)嚴(yán)重創(chuàng)傷而且血液大量丟失之后,損傷伴隨不同程度感染或應(yīng)激[19]會(huì)出現(xiàn)血容量降低與缺血缺氧狀態(tài)[20]，導(dǎo)致血液中TNF-α、IL-1、IL-6相關(guān)炎性因子出現(xiàn)繼發(fā)性的增高[21-24]，進(jìn)而出現(xiàn)應(yīng)激性高血糖狀態(tài)與脂質(zhì)代謝紊亂[25-27]。磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，參與體細(xì)胞的形成與脂肪酸消化吸收，對(duì)正常生理功能至關(guān)重要[17,28-29]。由圖5可知，在0～1 h期間對(duì)照組磷脂含量急劇下降，而卵黃組和大豆組因外源添加磷脂，改善了磷脂含量的降低。1 h 后，磷脂含量出現(xiàn)上升再恢復(fù)正常的狀態(tài)。與對(duì)照組和大豆組相比，卵黃組磷脂含量在6 h達(dá)到最大值(P<0.01)。大豆組磷脂含量變化波動(dòng)平緩。這可能是因?yàn)檠谴x異常，磷脂通過(guò)脂質(zhì)代謝避免血糖含量的異常變化對(duì)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激與損傷，因此出現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)。創(chuàng)傷性失血后，SPLs能控制血清中磷脂含量穩(wěn)定，磷脂代謝相對(duì)穩(wěn)定，緩解應(yīng)激性紊亂造成的損傷。

圖5 SD大鼠血清中磷脂變化情況Fig.5 Changes of phospholipids in serum of SD rats

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，外源蛋黃和大豆磷脂干預(yù)，顯著改善應(yīng)激性失血引起的血糖以及磷脂紊亂，抑制體質(zhì)量快速下降。但是由于本研究條件所限，對(duì)于具體的糖脂代謝酶以及氧化應(yīng)激狀態(tài)并未監(jiān)測(cè)，后期會(huì)繼續(xù)深入研究， 對(duì)本研究的結(jié)果進(jìn)行深入驗(yàn)證。

綜上所述，創(chuàng)傷失血后糖脂代謝出現(xiàn)紊亂，機(jī)體體質(zhì)量與飲食均會(huì)出現(xiàn)異常。如果在早期使用磷脂，能夠改善損害狀態(tài)，幫助機(jī)體恢復(fù)正常狀態(tài)。磷脂在改善由失血引起得糖脂代謝紊亂具有潛在的治療作用。