王帥，莊以彬，劉浩，畢慧萍*，劉濤

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)

糖苷類化合物是次級代謝中最重要的天然產(chǎn)物之一[1]。糖基化通常會對化合物的理化和生物特性產(chǎn)生顯著影響，包括溶解性、穩(wěn)定性和生物活性等[2]，使糖苷成為更具吸引力的化合物，廣泛應(yīng)用于藥物、食品添加劑和保健品等領(lǐng)域[3]。以珍稀藏藥紅景天活性成分紅景天苷為例，它具有抗氧化、抗疲勞和抗衰老的等作用，被廣泛添加于食品和保健品中[4]。因此，紅景天苷類似物的木質(zhì)素單體醇糖苷引起了我們的注意。構(gòu)效關(guān)系研究表明，木質(zhì)素單體醇糖苷的生物活性受到苯環(huán)上羥基的數(shù)量和位置、酚羥基上甲氧基的引入以及糖連接類型的影響[5-8]，因此，作為在苯環(huán)上具有2個羥基單元的咖啡醇糖苷，可能顯示出更優(yōu)的生物學和藥理學活性。但是目前咖啡醇糖苷的獲取仍是巨大的挑戰(zhàn)，雖然有報道從玉簪花(Hostaplantaginea)中分離出較低含量的天然咖啡醇-4-O-葡萄糖苷[9]，也有報道利用化學還原途徑，從相應(yīng)的苯基丙酸生產(chǎn)木質(zhì)素單體醇及其糖苷衍生物[10]，但植物提取和化學合成受限于起始資源、繁瑣的程序和較低的產(chǎn)量，從而限制了咖啡醇糖苷的研究和應(yīng)用。

近幾年，隨著合成生物學的發(fā)展，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物和高價值化學品成為一種具有廣闊應(yīng)用前景的生產(chǎn)方式[11]。2016年，CHEN等[12]將工程化的大腸桿菌進行共培養(yǎng)來合成一系列木質(zhì)素單體醇。2019年通過構(gòu)建人工生物合成途徑，實現(xiàn)了在大腸桿菌中生產(chǎn)肉桂醇糖苷及對香豆醇單-雙糖苷[13]。這使得通過微生物高效生產(chǎn)咖啡醇糖苷成為可能。

本文旨在利用微生物細胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)咖啡醇葡萄糖苷(合成途徑見圖1)。因羥化酶HpaBC具有底物寬泛性，易將酪氨酸氧化為不穩(wěn)定的中間體L-多巴，從而導致碳源的流失[12]，所以本研究采用共培養(yǎng)策略，降低HpaBC對酪氨酸的轉(zhuǎn)化。首先，在酪氨酸高產(chǎn)大腸桿菌菌株BTAL[13]中引入來自粘紅酵母的酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase,TAL)，來自歐芹的對羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4CL)，來自擬南芥的肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamyl-coa reductase,CCR)，并利用大腸桿菌內(nèi)源性醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADHs)或醛酮還原酶(aldosterone reductase,AKRs)，構(gòu)建了對香豆醇的生物合成途徑，該重組菌株命名為BTAL-CAD01。然后，將來自大腸桿菌的羥化酶HpaBC和來自擬南芥的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，得到重組菌株BWT-CAD01。通過共培養(yǎng)重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01成功實現(xiàn)了咖啡醇葡萄糖苷的生產(chǎn)。據(jù)我們所知，這是關(guān)于微生物發(fā)酵生產(chǎn)咖啡醇葡萄糖苷的首次報道，為后續(xù)構(gòu)效分析提供了新的候選化合物，有望得到具有較好生物活性的咖啡醇糖苷化合物，也為生物發(fā)酵法廉價生產(chǎn)咖啡醇糖苷提供借鑒意義。

圖1 咖啡醇葡萄糖苷的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway from glucose to caffeyl alcohol glucosides

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒(表1)

大腸桿菌DH5α用于克隆攜帶特定基因的質(zhì)粒，大腸桿菌BL21(DE3)及其改造菌株用于蛋白質(zhì)表達和目標化合物的合成，均由本實驗室提供。

表1 本研究使用的質(zhì)粒及菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 大腸桿菌培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于分子克隆、種子液培養(yǎng)、誘導蛋白表達、2步發(fā)酵的第1步培養(yǎng)，包括：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

M9Y培養(yǎng)基用于兩步法發(fā)酵的第2步發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方：5×M9 緩沖液，200 mL；20% 葡萄糖 100 mL；0.025% 酵母提取物 700 mL；1 mol/L MgSO42 mL；1 mol/L CaCl20.1 mL。

5×M9 緩沖液的配方：Na2HPO4·12H2O 85.5 g；KH2PO415 g,NaCl 2.5 g；NH4Cl 5 g，補水至1 000 mL。

根據(jù)需要將50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素添加到培養(yǎng)基中。

1.1.3 酶與試劑

1 kb DNA Ladder，天津樂寶生物科技有限公司；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR所用酶以及ClonExpress?非連接酶依賴型的多片段一步克隆技術(shù)試劑盒等，南京諾唯贊生物科技有限公司；T4連接酶，賽默飛世爾公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、凝膠回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

循環(huán)水式真空泵(SHB-ⅢA)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Hei-VAP.Value G3)，德國海道夫旋蒸儀公司；高效液相色譜制備系統(tǒng)(LC-6AD)，島津儀器(蘇州)有限公司；1260 Infinity UV檢測器和配備ESI電離探針的Bruker microQ-TOF II質(zhì)譜儀的Agilent 1260系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司和瑞士Bruker公司；核磁共振波譜儀Bruker Avance 400，瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究中使用的所有引物均列于表2。HpaBC基因通過PCR從大腸桿菌BL21(DE3)的基因組DNA中擴增而來(重組質(zhì)粒圖譜見圖2)。

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

圖2 重組質(zhì)粒圖譜Fig.2 Maps of recombinant plasmids

通過使用限制性位點BamH I和EcoR I將HpaBC片段酶連插入pCDFDuet-1來構(gòu)建pCDFDuet-HpaBC。利用引物73C5-5F/73C5-3R PCR，以根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化并合成的基因AtUGT73C5為模板進行PCR擴增，通過BamH I和SalI酶切AtUGT73C5片段，并連接到BamH I和SalI酶切的載體pRSFDuet-1中，得到重組質(zhì)粒pRSFDuet-AtUGT73C5。重組質(zhì)粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL-RgTAL的構(gòu)建已在之前的工作中進行了描述[15]，重組質(zhì)粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL-RgTAL-HpaBC的構(gòu)建與之前的工作[13]方法一致，添加的引物:RgTAL-3R、HpaBC-5F和HpaBC-3R。

1.2.2 微生物發(fā)酵生產(chǎn)咖啡醇糖苷

采用兩步發(fā)酵法生產(chǎn)目標化合物。在第1階段，將重組大腸桿菌菌株BTAL-CAD01、BWT-CAD01的單個克隆分別接種到5 mL液體LB培養(yǎng)基中，并在37 ℃以200 r/min培養(yǎng)過夜。然后將1 mL的BTAL-CAD01、BWT-CAD01種子液分別轉(zhuǎn)移至50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8，并添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)在16 ℃，200 r/min培養(yǎng)12～16 h以誘導蛋白表達。然后于4 000 r/min離心10 min收獲細胞，用M9Y液體培養(yǎng)基將細胞重懸OD600值至2.0。在第2階段，將第1階段重懸后的BTAL-CAD01和BWT-CAD01細胞，以50 mL的總體積量，分別以7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3的體積比混合。于30 ℃ 200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)發(fā)酵96 h,以一定時間間隔取樣，進行HPLC分析和OD600值測量。單菌BTAL-D發(fā)酵同樣采用50 mL總體積兩步發(fā)酵法。

1.2.3 化合物的純化

將2 L重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01的混合發(fā)酵液離心，收集上清液并用三菱SP825L型大孔吸附樹脂吸附，使用1體積(BV)不同體積分數(shù)的乙醇(10%、20%、30%、60%和80%)梯度洗脫目標化合物。利用HPLC分析確定洗脫液中含有目標化合物的成分，通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，最后將粗提取物重懸于3 mL甲醇中。利用半制備HPLC純化咖啡醇單糖苷。使用YMC-pack ODS-A(10 mm×250 mm,5 μm)進行化合物分離，洗脫條件除流速為4 mL/min外，其他與HPLC分析方法相同。

1.2.4 化學分析與定量

重組菌株的次級代謝產(chǎn)物使用配備有1260 Infinity UV檢測器和配備ESI電離探針的Bruker microQ-TOF II質(zhì)譜儀的Agilent 1260系統(tǒng),通過LC-MS分析。使用Innoval C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行HPLC分析?？Х却计咸擒盏南疵摋l件為：溶劑A，H2O(含體積分數(shù)0.1%甲酸)；溶劑B，甲醇；流速，1 mL/min；0～5 min，80%A和20%B，6～25 min，80%A和20%B到100%B(線性梯度)。25～30 min，100%B； 31～40 min，含20%B。所有產(chǎn)物均在254 nm波長處檢測到。MS分析以陽離子模式進行。用一系列已知濃度的發(fā)酵產(chǎn)生的純化的咖啡醇單糖苷化合物生成標準校準曲線。所有實驗一式3份進行，并重復(fù)至少2次，滴度表示為平均值±SD。

1.2.5 核磁共振分析

NMR實驗在Bruker Avance 400(德國卡爾斯魯厄)上進行，樣品溶于500 μL CD3OD。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌共培養(yǎng)生產(chǎn)咖啡醇單糖苷

用HpaBC和UGT73C5進一步擴展之前構(gòu)建的對香豆醇途徑[15]來生產(chǎn)咖啡醇單糖苷。HpaBC廣泛存在于大腸桿菌B、C和W系基因組中，但相關(guān)報道證明通過誘導其過表達才能發(fā)揮羥化作用[12-15]。因羥化酶HpaBC具有底物寬泛性，易將酪氨酸氧化為不穩(wěn)定的中間體L-多巴，從而導致碳源的流失[12]。所以單菌BTAL-D生產(chǎn)咖啡醇及其糖苷產(chǎn)量并不理想(圖3-a和圖6-a)。共培養(yǎng)策略旨在最大程度地降低HpaBC對酪氨酸的消耗(圖1)。在第1個培養(yǎng)階段，分別誘導了含有pCDFDuet-RgTAL-Pc4CL-AtCCR和pRSFDuet-1的重組大腸桿菌菌株BTAL-CAD01、含有pCDFDuet-HpaBC和pRSFDuet-AtUGT73C5的重組大腸桿菌菌株BWT-CAD01。然后將培養(yǎng)的BTAL-CAD01和BWT-CAD01的細胞以1∶1的比例混合并在第2階段共培養(yǎng)96 h。LC-MS檢測結(jié)果顯示，除咖啡醇(圖3-b，峰1)外，還產(chǎn)生了峰2、3和4三個新峰(圖3-b，峰2、3和4)，MS分析顯示化合物2、3和4具有相同的相對分子質(zhì)量314.10，推斷為3個咖啡醇單葡萄糖苷(圖3-d～圖3-f)。為進一步確定3個咖啡醇單葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)，我們進行了2 L混菌發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2 咖啡醇糖苷的分析與定量

將2 L重組菌株BTAL01和BWT01的混合發(fā)酵液離心，制備得到咖啡醇單糖苷，通過LC-MS和NMR分析確定并鑒定了2個咖啡醇單葡萄糖苷，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷和咖啡醇-9-O-葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)(圖4和圖5)。優(yōu)勢單糖苷化合物4被證明是咖啡醇-4-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰4；圖4)，其最高產(chǎn)量在72 h內(nèi)達到(126.98±2.42)mg/L(圖6-a)?；衔?經(jīng)NMR分析鑒定為咖啡醇-9-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰3；圖5)。化合物2制備量不足，未進行NMR分析，因咖啡醇結(jié)構(gòu)中共有3個—OH基團可被UGT73C5糖基化，化合物3和4已經(jīng)鑒定為咖啡醇-9-O-葡萄糖苷和咖啡醇-4-O-葡萄糖苷，推斷化合物2為咖啡醇-3-O-葡萄糖苷?？Х却?3-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰2)和咖啡醇-9-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰3)由于產(chǎn)量較低，未能定量。發(fā)酵72 h后，殘留有大量咖啡醇(圖3-b，峰1)。

a-HPLC分析重組菌株BTAL-D發(fā)酵上清液中的產(chǎn)物；b-HPLC分析共培養(yǎng)的重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01混合培養(yǎng)的發(fā)酵上清液中的產(chǎn)物；c-產(chǎn)物1(咖啡醇);d-產(chǎn)物2(咖啡醇-3-O-葡萄糖苷);e-產(chǎn)物3(咖啡醇-9-O-葡萄糖苷);f-產(chǎn)物4(咖啡醇-4-O-葡萄糖苷)圖3 大腸桿菌共培養(yǎng)生產(chǎn)咖啡醇單糖苷Fig.3 Production of caffeyl alcohol monoglucosides by E.coli co-culture

圖4 咖啡醇-4-O-葡萄糖苷氫譜和碳譜圖Fig.4 1H and 13C NMR spectrum of caffeyl alcohol-4-O-glucoside (4) in CD3OD

圖5 咖啡醇-9-O-葡萄糖苷氫譜和碳譜圖Fig.5 1H and 13C NMR spectrum of caffeyl alcohol-9-O-glucoside (3) in CD3OD

將樣品溶于500 μL CD3OD，進行核磁檢測，化學位移以δ(ppm)表示，耦合常數(shù)(J)以赫茲(Hz)給出：

化合物 3：1H-NMR(400 MHz，CD3OD) δ:6.88(1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.70(1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.73(1H, dd, J=8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.51(1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 6.12(1H, dt, J=15.9, 6.6 Hz, H-8), 4.48(1H, dd, J=12.5, 6.5 Hz, H-9a), 4.27(1H, dd, J=12.5, 7.0 Hz, H-9b), 4.36(1H, d, J=7.8 Hz, H-1′), 3.88(1H, dd, J=12.0, 2.1 Hz, H-6′a), 3.68(1H, dd, J=12.0, 5.3 Hz, H-6′b), 3.21～3.36(4H, m, Glu-H-2′, 3′, 4′, 5′).13C NMR(150 MHz, CD3OD) δ:129.0(C-1), 112.6(C-2), 144.9(C-3), 145.1(C-4), 114.8(C-5), 118.6(C-6), 133.0(C-7), 121.9(C-8), 69.6(C-9), 101.7(C-1′), 76.5(C-2′), 73.7(C-3′), 70.3(C-4′), 76.7(C-5′), 61.4(C-6′)。

化合物 4：1H-NMR(400 MHz，CD3OD) δ:6.96(1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 7.15(1H, J=8.5 Hz, H-5), 6.86(1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz, H-6), 6.51(1H, d, J=15.8 Hz, H-7), 6.24(1H, dt, J=16.0, 5.7 Hz, H-8), 4.22(2H, d, J=7.0 Hz, H-9), 4.79(1H, d, J=7.0 Hz, H-1′), 3.93(1H, d, J=12.0 Hz, H-6′a), 3.75(1H, dd, J=12.0, 4.8 Hz, H-6′b), 3.33～3.53(4H, m, Glu-H-2′, 3′, 4′, 5′).13C NMR(150 MHz, CD3OD) δ:132.9(C-1), 113.2(C-2), 147.0(C-3), 145.0(C-4), 117.3(C-5), 118.2(C-6), 129.9(C-7), 127. 4(C-8), 62.3(C-9), 102.8(C-1′), 76.2(C-2′), 73.5(C-3′), 69.9(C-4′), 76.9(C-5′), 61.0(C-6′)。

2.3 優(yōu)化發(fā)酵比例提高咖啡醇單糖苷的產(chǎn)量

為了提高咖啡醇單糖苷的產(chǎn)量，測試了BTAL-CAD01和BWT-CAD01的不同體積比混合比例(7∶1～1∶3)。結(jié)果顯示，當BTAL-CAD01和BWT-CAD01的混合體積比為3∶1,發(fā)酵72 h時，咖啡醇-4-O-葡糖苷的產(chǎn)量最高，達到(139.06±1.55) mg/L(圖6-a)，是單菌BTAL-D生產(chǎn)咖啡醇-4-O-葡糖苷產(chǎn)量(14.59±0.82) mg/L的9.53倍。當BTAL-CAD01和BWT-CAD01的體積比為3∶1，發(fā)酵72 h時，中間產(chǎn)物咖啡醇剩余量最少，為(96.78±3.16)mg/L，說明3∶1混合比例消耗了咖啡醇，促進了咖啡醇-4-O-葡糖苷的生產(chǎn)(圖6-a)，1∶3和單菌BTAL-D咖啡醇剩余量分別為(38.09±2.35)和(42.60±1.09) mg/L的原因是因為本身生產(chǎn)能力不足。在第2個發(fā)酵階段中，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的產(chǎn)量在48 h內(nèi)迅速增加，然后在96 h內(nèi)逐漸達到最高值(141.63±3.42) mg/L(圖6-b)。

圖6 通過優(yōu)化大腸桿菌共培養(yǎng)比例提高咖啡醇單糖苷的生產(chǎn)Fig.6 Production optimization of caffeyl alcohol monoglucosides by E.coli co-culture

3 總結(jié)

微生物發(fā)酵法作為一種潛在而有效的技術(shù)已被用于不同天然產(chǎn)物的異源生物合成中[16]，它提供了一種綠色且可持續(xù)的方法。為了最大程度地減少HpaBC與酪氨酸接觸形成不穩(wěn)定的中間體L-多巴，導致碳源的損失，本文設(shè)計共培養(yǎng)發(fā)酵的方法，合成了3種咖啡醇葡萄糖苷，同時測試了不同混合比例的BTAL-CAD01和BWT-CAD01來提高咖啡醇單糖苷的生產(chǎn)率，當二者混合比例設(shè)為3∶1時，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的產(chǎn)量最高，是單菌生產(chǎn)咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的9.53倍。后續(xù)可通過篩選挖掘底物選擇性更專一及催化活性更高的糖基轉(zhuǎn)移酶，并通過對莽草酸通路和UDP-糖通路的代謝調(diào)控，實現(xiàn)特定咖啡醇糖苷的高效合成。據(jù)我們所知，這是第一次實現(xiàn)微生物中咖啡醇糖苷的生物合成。除咖啡醇-4-O-葡萄糖苷以外，其他2種咖啡醇糖苷都是非天然化合物。作為在苯環(huán)上具有2個羥基單元的木質(zhì)素單體醇糖苷，與其他木質(zhì)素單體醇糖苷衍生物相比，咖啡醇糖苷有望表現(xiàn)出獨特的生物學和藥理活性。這些咖啡醇糖苷的非天然類似物將為構(gòu)效關(guān)系研究提供基礎(chǔ)材料，并有望發(fā)現(xiàn)具有改善的生物活性和藥理特性的新類似物。