雷棋琴 戢水玲 黃任衡 高 宏 徐旭東 孔任秋

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所中國(guó)科學(xué)院藻類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

多變魚(yú)腥藻(Anabaena variabilis)ATCC 29413是一種淡水絲狀藍(lán)藻,在缺氮條件下藻絲中一些間隔分布的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化為異形胞進(jìn)行固氮;在干旱等極端環(huán)境下還可以分化形成厚壁孢子。該藻株不僅可以利用光合作用進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng),也能利用果糖作為碳源和能源在完全黑暗條件下異養(yǎng)生長(zhǎng);其最適生長(zhǎng)溫度為30℃,但在40℃高溫條件下生長(zhǎng)狀態(tài)良好,屬于中等嗜熱型藻[1]。利用絲狀藍(lán)藻的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng),多變魚(yú)腥藻ATCC 29413高溫衍生株可以進(jìn)行遺傳操作,利用同源重組得到特定基因的突變株[2—6]。

具有異養(yǎng)生長(zhǎng)能力的藍(lán)藻依靠單糖或雙糖作為碳源[7—10],在光合作用、光合膜的發(fā)生等有關(guān)基因被失活時(shí)仍然能夠生長(zhǎng),為研究這些基因的功能提供了便利;作為光合細(xì)胞工廠,用于生產(chǎn)各種高價(jià)值化學(xué)品和生物燃料,也具有一定優(yōu)勢(shì)[11]。然而,多變魚(yú)腥藻ATCC 29413的接合轉(zhuǎn)移效率很低,影響了研究工作的開(kāi)展。我們對(duì)該藻株已發(fā)表的基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其含有兩套Ⅱ型限制修飾系統(tǒng),包括AvaⅠ/M.AvaⅠ和AvrⅡ/M.AvrⅡ。這兩種限制酶的存在可切斷進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA,妨礙接合子的形成。過(guò)去所用的絲狀藍(lán)藻接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的輔助質(zhì)粒pRL623上缺少甲基化酶M.AvrⅡ基因,可能與難以構(gòu)建多變魚(yú)腥藻突變株有關(guān)[12,13]。為了克服藻株的限制酶對(duì)外源DNA的破壞,本研究克隆了該藻株自身的兩個(gè)甲基化酶基因,構(gòu)建了新的輔助質(zhì)粒。利用該質(zhì)粒對(duì)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413兩個(gè)基因進(jìn)行了插入失活,均實(shí)現(xiàn)了一步獲得同源雙交換子,比通常在絲狀藍(lán)藻敲除基因節(jié)省一半時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 藻種、菌種及培養(yǎng)方法

多變魚(yú)腥藻ATCC 29413高溫衍生株由美國(guó)南達(dá)科塔州州立大學(xué)周阮寶教授惠贈(zèng)。藻株接種在稀釋8倍的AA液體培養(yǎng)基(AA/8)[14]或BG-11固體培養(yǎng)基[15]生長(zhǎng),接合轉(zhuǎn)移時(shí)固體培養(yǎng)基中添加5 mmol/L的果糖,突變?cè)逯甑呐囵B(yǎng)基中補(bǔ)加10 μg/mL的紅霉素(Em)。在(30±1)℃、30 μE/(m2·s)持續(xù)光照條件下靜置培養(yǎng),通過(guò)測(cè)定A730來(lái)監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng),待藻細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌(Escherichia coli)在37℃的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),含有質(zhì)粒的大腸桿菌根據(jù)所帶抗性基因補(bǔ)加50 μg/mL壯觀霉素(Sp)、氨芐青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)、10 μg/mL的氯霉素(Cm)或10 μg/mL四環(huán)素(Tc)。

1.2 藍(lán)藻基因組提取和PCR反應(yīng)

藍(lán)藻基因組提取和PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)[16],引物合成和序列分析在武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

DNA重組按Molecular Cloning[18]描述的方法進(jìn)行。限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、質(zhì)粒pMD18-T購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒pHB518(GenBank登錄號(hào)EF688562.1)和pHB576(GenBank 登錄號(hào)EF688561.1)是本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的載體。pDS4101[2]、pRL443[2]、pRL623[13]、pRL277(GenBank 登錄號(hào)L05082.1)和pACYC184(GenBank 登錄號(hào)X06403.1)由美國(guó)密歇根州立大學(xué)Peter Wolk教授惠贈(zèng)。

輔助質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413限制酶的甲基化酶基因M.AvaI和M.AvrII(ava_3181和ava_4359)的DNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表1),兩個(gè)基因的上游引物序列在ATG前7個(gè)堿基設(shè)計(jì)典型核糖體結(jié)合位點(diǎn)AGGAGG,M.AvrII基因的上游引物設(shè)計(jì)上終止密碼子用于終止插入載體pACYC184上四環(huán)素抗性基因的翻譯。以野生型多變魚(yú)腥藻ATCC 29413基因組為模板,以引物M.AvaI p-1/p-2和M.AvrII p-1/p-2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到大小為1.45 kb的M.AvaI基因和1.28 kb的M.AvrII基因,經(jīng)過(guò)純化連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化E.coliDH10B,得到質(zhì)粒pHB6065和pHB6067,感受態(tài)菌制作方法參照文獻(xiàn)[19]。將質(zhì)粒pHB6065用BamHⅠ酶切補(bǔ)平后再用SphⅠ酶切,瓊脂糖電泳回收1.45 kb的M.AvaI片段,同時(shí)將質(zhì)粒pHB6067用SalⅠ酶切補(bǔ)平后再用SphⅠ酶切,回收線性化4 kb大小帶M.AvrII的載體片段。將目的片段與載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH10B,得質(zhì)粒pHB6087;將pHB6087質(zhì)粒上2.7 kb的BamHⅠ(補(bǔ)平)和SalⅠ雙酶切片段(含有M.AvaI和M.AvrII)克隆到質(zhì)粒pACYC184的EcoRV和SalⅠ雙酶切位點(diǎn),得到輔助質(zhì)粒pHB6088。所有構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。

用于基因插入失活的運(yùn)載質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已公布的基因ava_1237和ava_4412序列發(fā)現(xiàn)兩基因大小分別為1.42和0.48 kb。為了便于同源交換,在每個(gè)基因兩側(cè)分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物(表1),以多變魚(yú)腥藻基因組DNA為模板,利用引物ava_1237 p-1/p-2擴(kuò)增出基因ava_1237上游0.71 kb的片段,以引物ava_1237 p-3/p-4擴(kuò)增出基因ava_1237下游0.70 kb的片段,將兩片段分別克隆到質(zhì)粒pHB518和pHB576的Eam1105Ⅰ位點(diǎn),同時(shí)刪除了以上兩個(gè)質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因(Cmr)得到質(zhì)粒pHB5225和pHB5235,用NotⅠ酶切pHB5235,插入從pHB5225中用NotⅠ酶切回收的約2.7 kb片段(含有ava_1237上游片段+Emr);通過(guò)PCR鑒定,選擇上下游片段方向一致的克隆,得到質(zhì)粒pHB5245;用PvuⅡ酶切pHB5245,回收約3.7 kb片段(含有ava_1237上游片段+Emr+ava_1237下游片段),將其插入到pRL277質(zhì)粒PstⅠ位點(diǎn)(PstⅠ酶切并補(bǔ)平)得到運(yùn)載質(zhì)粒pHB5255。

表1 本文所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

同樣的以多變魚(yú)腥藻基因組DNA為模板,利用引物ava_4412 p-1/p-2擴(kuò)增出基因ava_4412上游0.69 kb的片段,以引物ava_4412 p-3/p-4擴(kuò)增出基因ava_4412下游0.86 kb的片段,將兩片段分別克隆到質(zhì)粒pHB518和pHB576的Eam1105Ⅰ位點(diǎn),同時(shí)刪除了以上兩個(gè)質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因得到質(zhì)粒pHB5231和pHB5241;用Sse8387Ⅰ酶切pHB5241,插入從pHB5231中用Sse8387Ⅰ酶切并回收的約2.6 kb片段(含有ava_4412上游片段+Emr);通過(guò)PCR鑒定,選擇上下游片段方向一致的克隆,得到質(zhì)粒pHB5251;用PvuⅡ酶切pHB5251,回收約3.7 kb片段(含有ava_4412上游片段+Emr+ava_4412下游片段),將其插入到pRL277質(zhì)粒PstⅠ位點(diǎn)(PstⅠ酶切并補(bǔ)平),得到運(yùn)載質(zhì)粒pHB5261。

1.4 接合轉(zhuǎn)移菌株的構(gòu)建

在接合轉(zhuǎn)移前需要把幾種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一個(gè)菌株,其中包括輔助質(zhì)粒、運(yùn)載質(zhì)粒和接合質(zhì)粒。首先通過(guò)轉(zhuǎn)化將輔助質(zhì)粒和運(yùn)載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞E. coliDH10B,然后將含有接合質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞與含有輔助質(zhì)粒和運(yùn)載質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上交叉劃線,長(zhǎng)出的細(xì)胞即是含有輔助質(zhì)粒、運(yùn)載質(zhì)粒和接合質(zhì)粒的菌株。

輔助質(zhì)粒pHB6088轉(zhuǎn)化到E. coliDH10B(pDS4101)細(xì)胞中,得到菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088)。再將兩個(gè)運(yùn)載質(zhì)粒pHB5255和pHB5261分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH10B(pDS4101+ pHB6088)中,得到含3種質(zhì)粒的菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運(yùn)載質(zhì)粒)。用接種環(huán)將上述含3個(gè)質(zhì)粒的菌株與E. coliHB101(pRL443)在含有Ap、Cm、Sp、和Tc四種抗性的固體LB平板上交叉劃線,質(zhì)粒pRL443自主轉(zhuǎn)移到含3質(zhì)粒的菌株中,得到含4種質(zhì)粒的菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)。另外將輔助質(zhì)粒pRL623轉(zhuǎn)化到含有運(yùn)載質(zhì)粒的細(xì)胞中,然后再與含有pRL443的菌株細(xì)胞交叉劃線,在三抗培養(yǎng)基(Cm、Sp和Tc)上篩選含有pRL623、運(yùn)載質(zhì)粒和pRL443的大腸桿菌細(xì)胞,得到E. coliDH10B(pRL623 +運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)。

1.5 接合轉(zhuǎn)移和突變株的篩選

接合轉(zhuǎn)移方法參照文獻(xiàn)[2]采用兩個(gè)途徑進(jìn)行,分別用菌株E.coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)和菌株E.coliDH10B(pRL623+運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)與多變魚(yú)腥藻ATCC 29413進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,按比例取50 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞(A730為0.4)和25 mL大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移細(xì)胞(A600為0.6),先將藻和菌分別用無(wú)抗的培養(yǎng)基洗3遍,再將藻和菌分別濃縮為1 mL,藻菌混合液涂于帶硝酸纖維素濾膜的無(wú)抗BG11平板(添加5% LB),每個(gè)BG11平板涂100—200 μL的藻菌混合液,恢復(fù)一天后再?gòu)臑V膜上洗下藻菌混合物,1800 r/min離心收集藻細(xì)胞后,將其涂于添加紅霉素和5 mmol/L果糖的固體BG11平板上等待接合子長(zhǎng)出。長(zhǎng)出的接合子在含紅霉素的BG11平板上劃線培養(yǎng),待長(zhǎng)出來(lái)之后轉(zhuǎn)入紅霉素抗性的30 mL AA/8液體培養(yǎng)基,根據(jù)不同的基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物,傳代分離純化后提取野生型和接合子基因組DNA做PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 用于甲基化保護(hù)的輔助質(zhì)粒

圖1 輔助質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Schematic diagram of construction of the helper plasmid

輔助質(zhì)粒的構(gòu)建流程如下(圖1):將多變魚(yú)腥藻ATCC 29413中限制酶(AvaⅠ和AvrⅡ)的甲基化酶基因ava_3181(M. AvaⅠ)和ava_4359(M. AvrⅡ)分別克隆到pMD18-T載體上,得到質(zhì)粒pHB6065和pHB6067。然后將質(zhì)粒pHB6065上的M. AvaⅠ基因以相同方向克隆到pHB6067質(zhì)粒M. AvrⅡ基因下游得到pHB6087。最后將串聯(lián)的M. AvaⅠ和M.AvrⅡ插入到質(zhì)粒pACYC184四環(huán)素抗性基因中間,得到輔助質(zhì)粒pHB6088。pHB6088利用四環(huán)素抗性基因的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)M. AvrⅡ和M. AvaⅠ的轉(zhuǎn)錄(圖1),基因M. AvrⅡ上游設(shè)計(jì)帶有終止密碼子(Stop codon)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS),Stop codon用于終止Tcr上游序列的翻譯,RBS為大腸桿菌典型核糖體結(jié)合位點(diǎn)(AGGAGG)。

2.2 用于基因敲除的運(yùn)載質(zhì)粒

基因ava_1237的側(cè)翼同源序列0.71和0.7 kb分別克隆到質(zhì)粒pHB518和pHB576得到質(zhì)粒pHB 5225和pHB5235,再將pHB5225的上游側(cè)翼同源序列連同Emr切下連接到pHB5235上得到質(zhì)粒pHB5245,質(zhì)粒pHB5245上的兩個(gè)側(cè)翼同源序列和Emr切下連到載體pRL277上得到運(yùn)載質(zhì)粒pHB5255。

基因ava_4412的側(cè)翼同源序列0.69和0.86 kb分別克隆到質(zhì)粒pHB518和pHB576得到質(zhì)粒pHB 5231和pHB5241,再將質(zhì)粒pHB5231的上游側(cè)翼同源序列和Emr切下連接到pHB5241上得到質(zhì)粒pHB5251,質(zhì)粒pHB5251上的兩個(gè)側(cè)翼同源序列和Emr切下連到載體pRL277上得到運(yùn)載質(zhì)粒pHB5261。

運(yùn)載質(zhì)粒pHB5255含有基因ava_1237上下游兩側(cè)分別約有0.7 kb的序列,其基因中間142 bp的序列被Em抗性基因置換,用于ava_1237基因失活研究;另一個(gè)運(yùn)載質(zhì)粒pHB5261含有ava_4412上游0.69 kb和下游0.86 kb序列,其基因中間126 bp的序列被Em抗性基因置換,用于ava_4412基因失活研究。兩個(gè)運(yùn)載質(zhì)粒上面還含有bom位點(diǎn)和用于雙交換篩選的蔗糖致死基因(sacB)及壯觀霉素抗性基因(Spr)。

2.3 基因的一步插入失活

本研究構(gòu)建了兩種接合轉(zhuǎn)移菌株E.coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)和E.coliDH10B(pRL623+運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443)。pDS4101提供接合轉(zhuǎn)移所需的Mob蛋白;pHB6088含有多變魚(yú)腥藻兩個(gè)甲基化酶基因(M. AvaⅠ和M. AvrⅡ),對(duì)運(yùn)載質(zhì)粒特定位點(diǎn)進(jìn)行甲基化保護(hù);pRL623上有來(lái)源于其他微生物的三種甲基化酶基因(M.AvaⅠ、M. Eco47Ⅱ和M. EcoT22Ⅰ)和Mob蛋白基因;接合質(zhì)粒pRL443,具有自主轉(zhuǎn)移特性并提供接合所需的性纖毛,質(zhì)粒上的tra基因叢編碼的蛋白能驅(qū)動(dòng)運(yùn)載質(zhì)粒從E. coli到藻細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移;運(yùn)載質(zhì)粒含bom位點(diǎn),克隆有本研究將要敲除的基因的上下游同源序列和插入其間的紅霉素抗性基因。

將以上菌株分別與多變魚(yú)腥藻ATCC 29413進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移后,在添加果糖和紅霉素的BG11平板上篩選。7—14d后,利用含有輔助質(zhì)粒pHB6088的菌株進(jìn)行的接合轉(zhuǎn)移平板開(kāi)始長(zhǎng)出接合子,每組都長(zhǎng)出20個(gè)左右的接合子,而利用含有輔助質(zhì)粒pRL623的菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的平板沒(méi)有接合子長(zhǎng)出。將接合子劃線到添加果糖和紅霉素的BG11固體平板培養(yǎng),長(zhǎng)出的藻落再接種到添加果糖和紅霉素的AA/8液體培養(yǎng)基中傳兩代。提取基因組DNA,在基因組與運(yùn)載質(zhì)粒同源序列的上下游兩側(cè)和紅霉素抗性基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物(表1),進(jìn)行PCR檢測(cè)與比較。這兩個(gè)突變株分別隨機(jī)檢測(cè)了2個(gè)(ava_1237)和4個(gè)接合子(ava_4412),都顯示發(fā)生了同源雙交換,而不是單交換(圖2),也就是省略了在絲狀藍(lán)藻構(gòu)建基因敲除突變株要先獲得單交換株的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟。圖2中泳道3和4都顯示獲得了基因ava_1237的雙交換突變,但泳道3檢測(cè)的接合子突變尚未完全分離(藍(lán)藻基因組有多拷貝,該接合子仍有野生型拷貝);泳道7和9是基因ava_4412完全分離的雙交換突變株,泳道8和10是未完全分離的突變株;泳道1、2和5、6是兩個(gè)基因的野生型對(duì)照。圖3為同源雙交換示意圖。

圖2 突變株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR examination of mutants

由于以PCR隨機(jī)檢查的6個(gè)接合子全部為雙交換株,本實(shí)驗(yàn)室敲除其他基因獲得的幾十個(gè)接合子也均為雙交換株,我們推測(cè)以該遺傳操作系統(tǒng)獲得的全部或絕大多數(shù)接合子均直接發(fā)生雙交換。因此,可按所得到的抗性接合子數(shù)除以藻細(xì)胞數(shù)計(jì)算通過(guò)接合轉(zhuǎn)移敲除基因的效率。結(jié)果顯示,用輔助質(zhì)粒pHB6088進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,獲得基因ava_4412插入失活突變株的效率約為4.95×10-8,基因ava_1237插入失活的效率約為4.09×10-8,而以pRL623作為輔助質(zhì)粒進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移未得到接合子。

圖3 同源雙交換示意圖Fig.3 Schematic diagram of homologous double crossover

3 討論

在絲狀藍(lán)藻中,通常利用接合轉(zhuǎn)移的方法來(lái)開(kāi)展遺傳操作[2],但接合轉(zhuǎn)移僅僅提供一個(gè)外源DNA導(dǎo)入藻細(xì)胞的途徑,DNA進(jìn)入后能否在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或整合還受多種因素的影響,尤其是藻株的限制修飾系統(tǒng)(R-M系統(tǒng))[12]。為了克服限制酶對(duì)外源DNA的降解,采用較多的方法是在導(dǎo)入藍(lán)藻之前對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾從而逃脫藍(lán)藻限制酶的切割[20]。因此在輔助質(zhì)粒上可克隆藻株的甲基化酶基因,在大腸桿菌對(duì)運(yùn)載質(zhì)粒進(jìn)行甲基化保護(hù),從而提高接合轉(zhuǎn)移的效率。比如用于魚(yú)腥藻PCC 7120接合轉(zhuǎn)移的輔助質(zhì)粒pRL623上就有三種甲基化酶基因(M. AvaⅠ、M. Eco47Ⅱ和M. EcoT22Ⅰ),針對(duì)其三種限制酶(AvaⅠ、AvaⅡ和AvaⅢ)進(jìn)行甲基化保護(hù),極大地提高了接合轉(zhuǎn)移效率[13]。本研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用絲狀藍(lán)藻輔助質(zhì)粒pRL623在對(duì)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413接合轉(zhuǎn)移時(shí)得不到接合子,通過(guò)克隆多變魚(yú)腥藻ATCC 29413基因組中的兩個(gè)甲基化酶基因(ava_3181和ava_4359),構(gòu)建輔助質(zhì)粒pHB6088,結(jié)果獲得了接合子,相對(duì)而言在一定程度上促進(jìn)了遺傳操作的成功。此外,利用這個(gè)接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和輔助質(zhì)粒pHB6088,我們又進(jìn)行了19個(gè)未知功能基因敲除或失活并獲得了成功。因此,輔助質(zhì)粒pHB6088比pRL623更有利于對(duì)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413進(jìn)行遺傳操作。

有研究表明在藍(lán)藻細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA由于被甲基化而不能轉(zhuǎn)化基因型為mcrA+的E. coliDH5a[21],這是由于在一些大腸桿菌株系中含有特異性降解甲基化DNA的限制酶系統(tǒng)[22,23]。本研究構(gòu)建的輔助質(zhì)粒在嘗試轉(zhuǎn)入E. coliDH5α(mcr+mrr+)菌株時(shí)無(wú)法得到轉(zhuǎn)化子,而轉(zhuǎn)入E. coliDH10B(mcr-mrr-)沒(méi)有障礙,這也說(shuō)明輔助質(zhì)粒上的甲基化酶基因有表達(dá),發(fā)揮了甲基化保護(hù)作用。

在藍(lán)藻的接合轉(zhuǎn)移中,一般運(yùn)載質(zhì)粒進(jìn)入藻細(xì)胞后需要經(jīng)歷單交換和雙交換兩個(gè)過(guò)程的篩選[24],現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413基因敲除的研究也是要先發(fā)生單交換[4—6]。但作者在基因敲除的過(guò)程中觀察到,多變魚(yú)腥藻ATCC 29413在某種條件下,可一步發(fā)生同源雙交換,直接跳過(guò)單交換篩選得到插入失活突變株,這在一定程度上縮短了獲得突變株的周期。通常接合轉(zhuǎn)移效率是依據(jù)導(dǎo)入能自主復(fù)制的質(zhì)粒獲得接合子的數(shù)量來(lái)計(jì)算的,而本研究導(dǎo)入的是不能復(fù)制的質(zhì)粒,進(jìn)入細(xì)胞后一步發(fā)生雙交換,所以獲得接合子的頻次不高。以一步發(fā)生雙交換的概率來(lái)看,本文所構(gòu)建的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)效率并不低。

我們對(duì)多變魚(yú)腥藻ATCC 29413基因組序列搜索比較發(fā)現(xiàn),該藻株也含有識(shí)別和切割特定位點(diǎn)甲基化DNA的Mrr限制系統(tǒng)(由ava_B0091基因編碼)[23,25]。推測(cè)如果運(yùn)載質(zhì)粒上有Mrr識(shí)別位點(diǎn)而目的基因側(cè)翼片段和抗性基因上沒(méi)有,很可能進(jìn)入藻細(xì)胞的DNA質(zhì)粒被部分切割、線性化,導(dǎo)致基因側(cè)翼片段直接與目標(biāo)基因進(jìn)行同源雙交換。因此,為了進(jìn)一步提高該藻株的接合轉(zhuǎn)移效率,構(gòu)建Mrr限制系統(tǒng)缺陷藻株,消除Mrr限制系統(tǒng)對(duì)DNA的影響也是有必要的。