唐 容 呂紅健 付 梅 蘇勝齊 姚維志

(西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,西南大學(xué)漁業(yè)資源環(huán)境研究中心,水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點實驗室,重慶 400716)

中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker),隸屬鯉科(Cyprinidae),鲃亞科(Barbinae),倒刺鲃屬(Spinibarbus),俗稱青波。中華倒刺鲃主要分布于長江上游及其主要支流中,是長江上游珍稀特有經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。近年來由于過度捕撈、環(huán)境污染、攔河建壩及產(chǎn)卵群體資源量極端匱乏等原因,中華倒刺鲃天然資源量呈逐年下降趨勢[2—4]。因此,為了恢復(fù)野生中華倒刺鲃的自然資源量,保護(hù)其分布水域的生物多樣性,并進(jìn)一步促進(jìn)漁業(yè)資源的可持續(xù)利用,已開展了多種資源養(yǎng)護(hù)措施,例如:設(shè)立水生生物自然保護(hù)區(qū)[5],開展人工培育苗種增殖放流活動[6—11]。據(jù)不完全統(tǒng)計,長江中上游每年放流的中華倒刺鲃人工培育幼魚超過40萬尾。為了科學(xué)有效的評估中華倒刺鲃的增殖放流效果,掌握中華倒刺鲃的移動分布規(guī)律,開展標(biāo)志放流是重要途徑,而合理的標(biāo)記方法又是標(biāo)志放流的前提。

魚類熒光標(biāo)記技術(shù)是采用熒光染料在魚體的鈣質(zhì)或骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成熒光標(biāo)記的標(biāo)記技術(shù),作為一種兼具體內(nèi)和體外標(biāo)志的標(biāo)記方法,目前已被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記軟骨魚類[12]和硬骨魚類[13],該標(biāo)記技術(shù)具有標(biāo)記費用低,對標(biāo)記魚的存活、生長和行為影響較小,標(biāo)記保存率較高,標(biāo)記易于發(fā)現(xiàn)等優(yōu)點[14,15]。目前國際上經(jīng)常使用的熒光染料主要有茜素紅S(Alizarin red S,ARS)[16]、茜素絡(luò)合物(Alizarin complexone,ALC)[17]、鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride,TCH)[18]和鈣黃綠素(Calcein,CAL)[19]等。此外,熒光標(biāo)記方法包括直接浸泡[20]、加強滲透[21]、投喂[22]和注射[23]四種。雖然有以上多種可用的熒光染料和標(biāo)記方法,但熒光標(biāo)記在魚類上的應(yīng)用也僅限于使用一種熒光染料對目標(biāo)魚種進(jìn)行單一標(biāo)記,很少有人進(jìn)行過雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記研究。此外,當(dāng)發(fā)現(xiàn)多種熒光染料適用于一個魚種,并且在同一研究中有多個該魚種的種群必須標(biāo)記和區(qū)分時,雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記將特別有用,這樣不僅能增加標(biāo)記模式(包括單一標(biāo)記、雙重標(biāo)記和三重標(biāo)記等),還能用于區(qū)分不同標(biāo)志放流群體。

本研究采用TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚進(jìn)行雙重?zé)晒鈽?biāo)記,考察不同濃度TCH和ARS雙重標(biāo)記對中華倒刺鲃幼魚生長和存活的影響,并探討2種熒光染料對中華倒刺鲃幼魚耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘的標(biāo)記效果,旨在為中華倒刺鲃的標(biāo)志放流提供潛在的標(biāo)記技術(shù),并進(jìn)一步增加魚類熒光標(biāo)記的標(biāo)記模式。

1 材料與方法

1.1 中華倒刺鲃實驗幼魚

2016年3月,從重慶靜觀養(yǎng)殖場采集全長為70—80 mm的中華倒刺鲃幼魚約300尾,將幼魚移至200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)10d,暫養(yǎng)用水為曝氣24h以上的自來水,日換水1次,換水量為10%。暫養(yǎng)期間每天的光照周期為12L﹕12D,且定時投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測定水質(zhì)指標(biāo),并將水質(zhì)控制在水溫16.0—17.7℃,pH 6.97—7.23,溶解氧6.91—7.42 mg/L。

1.2 雙重?zé)晒鈽?biāo)記染色實驗

先使用TCH對中華倒刺鲃幼魚進(jìn)行浸染標(biāo)記,實驗共設(shè)6個濃度梯度,即0、100、200、300、400和500 mg/L(表1)。各濃度梯度配制40 L熒光染液,并在配制完成后強曝氣24h,用以提高熒光染液的pH。然后,每個實驗組隨機取40尾中華倒刺鲃幼魚,浸染24h。在浸泡完后,將標(biāo)記魚放入曝氣自來水中2h,以洗去體表殘留熒光染料。隨后將6個實驗組標(biāo)記幼魚轉(zhuǎn)入6個裝有等體積曝氣自來水缸中繼續(xù)飼養(yǎng)72h,并統(tǒng)計急性死亡率。最后,將每個實驗組的標(biāo)記幼魚移入6個200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖水槽(養(yǎng)殖水體體積為1400 L,實驗魚養(yǎng)殖密度為0.028尾/L)中飼養(yǎng)30d。此階段為養(yǎng)殖生長實驗的第一階段(圖1),標(biāo)記幼魚的飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)期間相同。

表1 使用鹽酸四環(huán)素和茜素紅S雙重浸泡標(biāo)記的順序和濃度Tab.1 The order of double immersion marking and concentration sets for TCH and ARS of experimental group

圖1 雙重標(biāo)記后6個實驗組中華倒刺鲃平均全長(a)和體重(b)Fig.1 Mean total length(a)and body weight(b)of S. sinensis from six experimental groups after double fluorescent marking

在用TCH標(biāo)記30d后,使用ARS進(jìn)行相同浸染流程的標(biāo)記實驗。將先前使用TCH處理的6組中華倒刺鲃幼魚,分別對應(yīng)使用濃度為0、100、150、200、250和300 mg/L的ARS染液浸染處理24h(表1)。在浸染完成后,統(tǒng)計浸染后72h內(nèi)ARS二次浸泡標(biāo)記導(dǎo)致的急性死亡率。

1.3 生長實驗

為了評估兩次浸泡標(biāo)記后TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚生長和存活的復(fù)合效應(yīng),從每個處理組中隨機抽取36尾魚,用于隨后持續(xù)60d的生長實驗(即生長實驗的第二階段,圖1)。每個實驗組設(shè)3個平行組(n=12),分養(yǎng)于200 cm×100 cm(D×H)的圓柱形養(yǎng)殖水槽中(養(yǎng)殖水體體積為1400 L,實驗魚養(yǎng)殖密度為0.028尾/L),整個生長實驗過程中連續(xù)充氣,日換水1次,換水率為10%。每天定時投喂兩次浮性顆粒餌料,每次投飼率為魚體重的1%。投喂1h后,測定水質(zhì)指標(biāo),并將水質(zhì)控制在水溫19.4—25.9℃,pH 7.83—8.51,溶解氧6.76—7.37 mg/L,且光照周期為12L﹕12D。

在生長試驗的第一階段開始時,測量所有實驗魚的全長和體重,數(shù)據(jù)分別精確到0.1 mm和0.1 g。本研究的養(yǎng)殖實驗共持續(xù)90d(第一階段持續(xù)30d,第二階段持續(xù)60d,在養(yǎng)殖的第30、第60和第90天測定各處理組實驗魚的全長和體重(圖1)。此外,在整個生長試驗過程中記錄每組實驗魚的死亡率。

1.4 標(biāo)記檢測實驗

在生長實驗結(jié)束后,每個平行組取10尾魚(即每個實驗組共30尾),使用200 mg/L的MS-222(tricaine-methanesulfonate)麻醉致死后,取其矢耳石、星耳石、鱗片、倒刺和鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭)及鰭棘(包括背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭)。本研究所取樣本在清洗干凈后在室溫下避光保存,并在取樣20d內(nèi)完成標(biāo)記檢測。

使用裝有Leica DFC 495高分辨率數(shù)碼相機的Leica DM IL LED熒光顯微鏡和Leica EL6000Comp體式顯微鏡對所取樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記檢測(表2)。標(biāo)記效果參照Liu等[24]的方法。將熒光標(biāo)記清晰度劃分為0至5的6個等級。將標(biāo)記質(zhì)量用n表示,當(dāng)n≥2時,記作可接受標(biāo)記,即標(biāo)記質(zhì)量較好。為保證標(biāo)記等級劃分的準(zhǔn)確,所取樣品需由2名經(jīng)驗豐富的觀察者獨立觀察分析,如果結(jié)果不一致時需由第3位觀察者確定。在鑒定標(biāo)志效果期間,所有的樣品均未進(jìn)行打磨和拋光。

表2 用于檢測鹽酸四環(huán)素和茜素紅S標(biāo)記的雙色鏡和濾光片組合Tab.2 Dichromatic mirror and filter combination wavelength for visualizing TCH and ARS marks

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,每尾中華倒刺鲃幼魚的標(biāo)記質(zhì)量、全長及體重數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。最終采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)進(jìn)行處理組與對照組實驗魚死亡率、全長及體重的差異顯著性分析,設(shè)定差異顯著性水平P為0.05,當(dāng)P≤0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記對中華倒刺鲃幼魚存活和生長的影響

在整個實驗中各處理組標(biāo)記魚與對照組在兩次24h的浸染過程中,及浸染后72h的觀察期間均未出現(xiàn)死亡個體。在90d的養(yǎng)殖實驗期間,6個實驗組也未出現(xiàn)死亡個體,各實驗組之間的死亡率均無顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)單因素方差分析表明,處理組與對照組在0、30d、60d、90d養(yǎng)殖實驗過程中全長、體重也無顯著性差異(P＞0.05,圖1)。

圖2 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚矢耳石(a)和星耳石(b)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.2 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the sagittae(a)and asteriscus(b)of S. sinensis

2.2 內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)標(biāo)記效果

在本研究中,經(jīng)各濃度TCH和ARS標(biāo)記過的矢耳石(圖2和圖3)和星耳石(圖2和圖4)上均檢測到熒光標(biāo)記。將TCH和ARS標(biāo)記過的各內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍(lán)光照射下有兩種熒光標(biāo)記,分別是由TCH標(biāo)記產(chǎn)生的黃色熒光環(huán)和由ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且黃色熒光環(huán)比紅色熒光環(huán)更接近于耳石(包括星耳石和矢耳石)的內(nèi)部(圖3)。而在綠光照射下僅發(fā)現(xiàn)ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且該紅色熒光環(huán)比藍(lán)光照射下的更明亮(圖3)。此外,在浸染24h后,較高濃度處理組的矢耳石(≥300 mg/L TCH和≥150 mg/L ARS)和星耳石(≥300 mg/L TCH 和 ≥200 mg/L ARS)中均能檢測到明顯的標(biāo)記環(huán)(n≥2)。結(jié)果表明,實驗組Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的矢耳石和星耳石都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記。

2.3 外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)標(biāo)記效果

本研究結(jié)果顯示,各對照組魚體的各類外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)(鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘)中均檢測到熒光標(biāo)記。同上述內(nèi)部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)果類似,將TCH和ARS標(biāo)記過的各外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)樣品置于熒光顯微鏡下觀察,在藍(lán)光照射下有兩種熒光標(biāo)記,分別是由TCH標(biāo)記產(chǎn)生的黃色熒光環(huán)和由ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且黃色熒光環(huán)比紅色熒光環(huán)更接近于外部骨質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括倒刺、鰭條和鰭棘)的內(nèi)部。而在綠光照射下僅發(fā)現(xiàn)ARS標(biāo)記產(chǎn)生的紅色熒光環(huán),且該紅色熒光環(huán)比藍(lán)光照射下的更明亮(圖5、圖6和圖7)。

圖3 不同光源下中華倒刺鲃幼魚矢耳石的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.3 The effect of double fluorescent marking in sagittae of S. sinensis larval observed with different light sources

圖4 不同光源下中華倒刺鲃幼魚星耳石的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.4 The effect of double fluorescent marking in asteriscus of S. sinensis larval observed with different light sources

除100—300 mg/L TCH和100 mg/L ARS處理的側(cè)線鱗外,及100—300 mg/L TCH和100、150 mg/L ARS處理的非側(cè)線鱗外,在其余幾個處理組的側(cè)線鱗和非側(cè)線鱗上均能觀察到環(huán)形標(biāo)記,但是這些鱗片的熒光標(biāo)記效果并不明顯(0≤n≤1,圖8)。

經(jīng)400—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的倒刺中可以同時檢測到TCH和ARS的熒光標(biāo)記(n≥2,圖9)。結(jié)果表明,實驗組Ⅴ、Ⅵ的倒刺都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記(圖9)。

經(jīng)200—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS處理的鰭條(包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭),及經(jīng)300—500 mg/L TCH和200—300 mg/L ARS處理的鰭棘(除ARS濃度為100 mg/L處理后的腹鰭外)中均可以同時檢測到TCH和ARS的標(biāo)記環(huán)(n≥2,圖10和圖11)。結(jié)果表明,實驗組Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭條和實驗組Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的鰭棘都具有可接受的TCH和ARS標(biāo)記。

圖5 不同光源下中華倒刺鲃幼魚倒刺的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.5 The effect of double fluorescent marking in barb of S. sinensis larval observed with different light sources

圖6 不同光源下中華倒刺鲃幼魚背鰭的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.6 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin ray of S. sinensis larval observed with different light sources

最后,本研究中所有TCH和ARS雙重浸染處理的耳石、鱗片、倒刺、鰭條和鰭棘中均未觀察到肉眼可見的熒光標(biāo)記(即n＜4)。

3 討論

3.1 雙重?zé)晒鈽?biāo)記對實驗幼魚存活與生長的影響

一般而言,熒光染料對標(biāo)記動物生長和存活率的影響是衡量標(biāo)記適用性的一項重要指標(biāo)[25]。在2次24h浸染標(biāo)記過程中,72h標(biāo)記后的觀察期間,及90d的飼養(yǎng)期間各實驗組存活率均為100%,養(yǎng)殖實驗期間處理組與對照組的體重和全長無顯著性差異(P＞0.05),這與采用TCH和ARS浸染標(biāo)記其他魚類(包括單一標(biāo)記[26]和雙重標(biāo)記[27])的研究結(jié)果保持一致。但是,Beckman和Schulz[12]研究發(fā)現(xiàn),使用較高的濃度染料或增加對魚類的浸染時間,會導(dǎo)致標(biāo)記魚的死亡率在浸染期間及浸染后升高,從而降低標(biāo)記成功率。Liu等[24]認(rèn)為這些差異不僅是由高濃度染料和長時間浸染造成的,還可能與標(biāo)記個體處于不同的生命階段有關(guān)。本研究結(jié)果表明,適宜濃度下TCH(濃度為100—500 mg/L)和ARS(濃度為100—300 mg/L)標(biāo)記對后續(xù)中華倒刺鲃幼魚(全長為70—80 mm)生長和存活均沒有顯著影響。

3.2 雙重?zé)晒鈽?biāo)記對不同骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記效果與保持率

在熒光顯微鏡下觀察各類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記效果,結(jié)果顯示所有處理組側(cè)線鱗和非側(cè)線鱗的標(biāo)記效果較差(0≤n≤1),這與劉奇[28]使用ARS對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)進(jìn)行標(biāo)記時,產(chǎn)生的標(biāo)記效果基本一致。對比相同濃度下矢耳石和星耳石的雙重標(biāo)記效果,結(jié)果顯示矢耳石和星耳石的雙重標(biāo)記效果差別較小,這與付自東等[29]使用ALC標(biāo)記胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)耳石和何春林等[30]使用ALC和TCH標(biāo)記重口裂腹魚(Schizothorax davidi)耳石的研究結(jié)論有些出入,這可能與熒光染料種類、標(biāo)記魚體的生理階段、代謝速度及耳石形態(tài)等有關(guān)。此外,在較高濃度下浸泡的矢耳石、星耳石、倒刺、鰭條和鰭棘中均能檢測到明顯的標(biāo)記環(huán)(n≥2)。但是在透射光下,所有處理組被觀察的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)中均無肉眼可見的熒光標(biāo)記(即n＜4),這與Lü等[31]、劉巖等[32]的研究結(jié)果不同,Lü等[31]認(rèn)為要形成肉眼可見的標(biāo)記需要同時具備高劑量的染料、較長的浸染時間、海水環(huán)境及相對穩(wěn)定的pH等多個條件。在不同物種間產(chǎn)生最佳標(biāo)記效果所需的染料濃度和浸染時間是不同的。因此,本研究透射光下缺乏可見標(biāo)記可能是由于魚類物種差異或淡水和海水環(huán)境之間的差異造成的。

圖7 不同光源下中華倒刺鲃幼魚背棘的雙重?zé)晒鈽?biāo)記效果Fig.7 The effect of double fluorescent marking in dorsal fin spine of S. sinensis larval observed with different light sources

圖8 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚側(cè)線鱗(a)和非測線鱗(b)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.8 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the lateral line(a)and non-lateral line scales(b)of S. sinensis

圖9 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚倒刺的標(biāo)記質(zhì)量Fig.9 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the barbs of S. sinensis

能否通過標(biāo)記方法成功地評估魚類的增殖放流效果,關(guān)鍵在于是否能保證標(biāo)記的高保持率,以及在標(biāo)記過程中和放流后的低死亡率[24]。因此,標(biāo)記的保留時間是評價標(biāo)記適用性的另一項重要指標(biāo)[33]。Bashey[34]認(rèn)為不同保留時間可能與不同骨質(zhì)結(jié)構(gòu)、個體代謝差異、標(biāo)記檢測技術(shù)(如打磨、拋光)以及環(huán)境因子(如高溫、陽光)等有關(guān)。劉巖等[32]使用ARS對黑鯛幼魚進(jìn)行標(biāo)記并對其暫養(yǎng)2個月后,發(fā)現(xiàn)黑鯛幼魚的硬骨組織仍能保持清晰、肉眼可見的紫色標(biāo)記。Reinert等[35]研究發(fā)現(xiàn)條紋鱸(Morone saxatilis)耳石上的氧四環(huán)素(oxytetracycline,OTC)標(biāo)記可以持續(xù)保留3年。本研究結(jié)果顯示,在使用TCH標(biāo)記后的90d(即使用ARS標(biāo)記后的60d),除部分鱗片外,在其他被分析的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成的熒光標(biāo)記仍然清晰可見。因此,可以推測,TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚的雙重標(biāo)記保持時間較長,該標(biāo)記方法可用于中華倒刺鲃幼魚的標(biāo)志放流和增殖效果評估,為區(qū)分不同標(biāo)記放流群體提供了一定的技術(shù)手段。

圖10 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚背鰭(a)、胸鰭(b)、腹鰭(c)、臀鰭(d)和尾鰭(e)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.10 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c),anal(d)and caudal(e)fin rays of S. sinensis

3.3 雙重?zé)晒鈽?biāo)記的可行性和潛在應(yīng)用

近年來,由于放流的苗種數(shù)量多、規(guī)模大,往往需要進(jìn)行大規(guī)模的標(biāo)志放流,熒光染料浸泡標(biāo)記魚類是其中最常用的方法。該方法不僅能在短時間內(nèi)實現(xiàn)魚苗的大規(guī)模標(biāo)記,還能最大限度地降低人為操作對魚苗造成的傷害[29]。然而使用這種傳統(tǒng)的熒光染料浸泡標(biāo)記法來標(biāo)記魚類,可能難以區(qū)分被回捕標(biāo)記的多個同種魚類的放流群體。因此,對這一標(biāo)記方法的改進(jìn)以及對標(biāo)記模式的創(chuàng)新顯得尤其迫切。本研究結(jié)果表明,使用TCH和ARS兩種染料雙重浸泡標(biāo)記中華倒刺鲃幼魚效果良好。除處理組Ⅱ的側(cè)線鱗和處理組Ⅱ、Ⅲ的非側(cè)線鱗外(0≤n≤1),所有被分析的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)中均能檢測到熒光標(biāo)記(n≥2)。TCH標(biāo)記90d(即使用ARS標(biāo)記后的60d)后,除部分鱗片外,在其他的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)均具有高的保持率,可見使用TCH和ARS對中華倒刺鲃幼魚進(jìn)行快速、簡便的雙重?zé)晒鈽?biāo)記是可行的?；谝陨辖Y(jié)果,可以推測TCH和ARS除了適用于雙重標(biāo)記中華倒刺鲃外,還可以用于單一標(biāo)記或三重標(biāo)記,并且有12種潛在的標(biāo)記類型,包括單一標(biāo)記(2種),雙重標(biāo)記(4種)和三重標(biāo)記(6種)。Tsukamoto[27]也曾提出當(dāng)只有一種或兩種熒光染料可用時,雙重標(biāo)記或三重標(biāo)記能夠成為魚類標(biāo)記的新模式,同時還能確定上一次魚體被標(biāo)記時的大小。

圖11 TCH和ARS熒光染料對中華倒刺鲃幼魚背棘(a)、胸棘(b)、腹棘(c)和臀棘(d)的標(biāo)記質(zhì)量Fig.11 The mark quality of TCH and ARS fluorochrome dyes on the dorsal(a),pectoral(b),ventral(c)and anal(d)fin spines fin rays of S. sinensis

3.4 熒光標(biāo)記的局限性

近年來,熒光染料浸染標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于魚類增殖放流效果評估中。在大多數(shù)用于魚類和水生無脊椎動物的增殖放流的熒光標(biāo)記方案中,僅對放流群體的生長和存活率進(jìn)行了評估。Tsukamoto[26]指出熒光染料對標(biāo)記生物體沒有持久不利的影響。即使采用雙重浸染熒光標(biāo)記,當(dāng)前研究的結(jié)論也支持這一觀點。但是,Bumguardner和King[36]研究發(fā)現(xiàn),使用較高濃度OTC和CAL浸染標(biāo)記條紋鱸,結(jié)果會對其產(chǎn)生較大的毒性。此外,少數(shù)研究也已經(jīng)報道了熒光染料標(biāo)記具有潛在的不利影響,Meyer等[37]使用ALC對早期生命階段的波羅的海鱈(Gadus morhua)進(jìn)行批次標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物不僅會對鱈存活率產(chǎn)生顯著的急性影響,而且還會對其他重要參數(shù)(如生長)具有亞致死作用?；谶@些研究,Lü等[31]推斷熒光染料的毒性跟染料種類、染料濃度、魚的生命階段及環(huán)境因子(如溫度)等有關(guān)。本研究采用TCH和ARS對中華倒刺鲃進(jìn)行雙重浸染標(biāo)記,兩種熒光標(biāo)記的保留時間分別為90d和60d。對于熒光標(biāo)記,標(biāo)記保留時間的延長也意味著相應(yīng)結(jié)構(gòu)中熒光染料殘留的時間延長。因此,魚類組織中熒光染料的化學(xué)殘留物(如鱗片、肌肉、血液、肝臟和腎臟)可能會影響到食品安全。特別是對于一些經(jīng)濟(jì)魚類而言。到目前為止,盡管已經(jīng)有研究者對魚體內(nèi)熒光染料的代謝進(jìn)行檢測,但是關(guān)于檢測不同魚類組織中CAL、ALC、ARS、TCH和OTC等熒光染料殘留的文獻(xiàn)報道甚少。綜上所述,在未來的研究中,使用熒光標(biāo)記前必須先研究熒光染料對目標(biāo)標(biāo)記魚的毒性,并進(jìn)一步量化熒光染料在魚體組織中的代謝速度和殘留量。

綜上所述,TCH和ARS的雙重浸染適用于中華倒刺鲃幼魚的大批量標(biāo)記,我們推薦把TCH和ARS的單一或雙重浸染作為中華倒刺鲃幼魚的一種標(biāo)記手段。此外,除部分鱗片以外,熒光染料對倒刺、鰭條和鰭棘的標(biāo)記效果良好,可以在不殺死標(biāo)記魚的情況下獲得標(biāo)記信息,這些標(biāo)記將會在生物標(biāo)記實驗或增殖放流標(biāo)記實驗中發(fā)揮重要作用。但是出于對食品安全的考慮,在未來的研究中,使用TCH和ARS標(biāo)記評估中華倒刺鲃增殖放流的項目成功之前,應(yīng)先對熒光染料的毒性進(jìn)行研究,并且需要進(jìn)一步量化組織中熒光染料的殘留量和研究熒光染料在標(biāo)記魚體內(nèi)的代謝情況。