李 穎 王 丁* 肖武漢*

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所,武漢 430072;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護重點實驗室,武漢 430072)

鯨類作為哺乳動物中極其特殊的一個分支,其生理結(jié)構(gòu)、分子調(diào)控機制和進化機制具有重要的研究價值,如鯨類特殊的回聲定位系統(tǒng),特殊的皮膚和滲透壓調(diào)節(jié)機制以及潛水適應(yīng)機制[1]。此外鯨類作為水生態(tài)系統(tǒng)的頂端捕食者,對維持食物鏈的完整性和連續(xù)性具有重要意義。

長江江豚(Neophocaena phocaenoids asiaeorientalis)隸屬齒鯨亞目鼠海豚科江豚屬,是鼠海豚科唯一的淡水種群,分布于我國長江中下游干流宜昌至上海區(qū)段、鄱陽湖、洞庭湖及部分支流[2,3]。從1996年國際自然保護聯(lián)盟物種生存委員會(IUCN)紅皮書將長江江豚列為瀕危(EN)物種,到2013年IUCN瀕危物種紅色名錄中的極度瀕危（CR）。隨著人類擾動的持續(xù)增強,長江江豚的數(shù)量仍在持續(xù)下降[4—6],非自然死亡現(xiàn)象頻發(fā),若長江環(huán)境得不到改善,種群必將出現(xiàn)更為劇烈的下降,甚至是種群滅絕[7]。對于這種長江珍惜瀕危鯨類,亟待我們采取多種拯救和保護措施,以避免其陷入不可挽回的局面。

鯨豚類營水生生活,活動范圍廣,動物實驗無法開展;同時因倫理、法律等原因,損傷鯨豚類個體的實驗難以開展,這些在一定層面上限制了對鯨豚類生命機制的探索。20世紀(jì)70年代,細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)開始蓬勃發(fā)展,很多鯨類學(xué)者借助細(xì)胞培養(yǎng)體外平臺開展鯨類體外培養(yǎng)的相關(guān)的研究,包括大翅鯨(Megaptera novaeangliae)、侏儒抹香鯨(Kogia breviceps)、侏虎鯨(Feresa attenuata)、露脊鯨(Eubalaena japonica)和白鯨(Delphinapterus leucas)等[8—12]。體外培養(yǎng)細(xì)胞保持了動物個體的細(xì)胞和遺傳特性,從某些方面克服了鯨豚類動物活體實驗的限制。在成功分離具有活性的細(xì)胞后,借助顯微觀測技術(shù)以及分子檢測手段可以開展鯨豚類細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和毒理學(xué)等相關(guān)研究[13—15]。由于鯨類原代細(xì)胞具有難以培養(yǎng)特性,在體外傳代次數(shù)有限[16],難以滿足某些實驗要求。SV40T(Simian virus 40 T-antigen)被認(rèn)為是建立永生化細(xì)胞最簡單可靠的基因[17]而被廣泛使用。鯨類學(xué)者將其應(yīng)用到鯨類細(xì)胞永生化的實驗中。主要是將攜帶SV40T抗原的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鯨豚類細(xì)胞,以期獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株[18]。

目前長江江豚的研究集中在噪聲、生態(tài)學(xué)、生理和行為方面[19—22],有關(guān)長江江豚細(xì)胞層面的研究極少。除了2010和2011年,王京真等[23,24]報道多長江江豚細(xì)胞的培養(yǎng)條件和染色體核型外,后續(xù)長江江豚的細(xì)胞系的研究未見報道。隨著長江江豚全基因測序的完成,長江江豚的研究已經(jīng)進入了分子生化時代。建立穩(wěn)定的長江江豚細(xì)胞系,便于我們利用影像技術(shù)進行形態(tài)結(jié)構(gòu)分析,使用分子、生化和免疫技術(shù)進行物質(zhì)變化檢測。建立穩(wěn)定的長江江豚細(xì)胞系也為細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等提供穩(wěn)定均一的研究樣品,便于后續(xù)開展江豚的免疫應(yīng)答機制和此外,構(gòu)建穩(wěn)定長江江豚細(xì)胞系,可以更好的將先進分子技術(shù)手段運用于長江江豚的疾病治療、飼養(yǎng)繁殖等工作中[25]。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料實驗所用臍帶來于一母豚產(chǎn)子后產(chǎn)下的胎盤。從幼豚產(chǎn)出到胎盤產(chǎn)出約8h,胎盤重約0.72 kg,胎盤上臍帶約為17 cm。

主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Gibco)、胎牛血清(Fetal bovine serum;Hyclone)、青霉素-鏈霉素(Penicillins-Streptomycin;BI)、兩性霉素B(Amphotericin B,BI)、PrimocinTM(InvivoGen)、胰酶(Tripsin-EDTA;Hyclone)、PBS(phosphate-buffered solution,without Ca2+and Mg2+)、CCK-8試劑盒(cell counting kit 8;上海翊圣)、Lipofectamine 3000 Reagent(Invitrogen)和SV40 T antigens(pW2載體;中國科學(xué)院水生生物研究所魚類低氧生物學(xué)實驗室,武漢）

倒置熒光顯微鏡(徠卡DMi8-電動;Leica)、Spectra Max i3x多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max i3x:Molecular Devices)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Forma Class II Water Jacked CO2Incubator;Thermo)、超凈工作臺(Forma Class II A2 Biological Safety Cabinet;Thermo)和離心機(Centrifuge 5702;Eppendorf)。

1.2 方法

臍帶組織的收集胎盤在長江江豚生產(chǎn)8h后產(chǎn)出,胎盤產(chǎn)出后,使用無菌工具取3份3 cm的臍帶,用終濃度為100 U/mL的雙抗和5.0 μg/mL兩性霉素B的PBS溶液洗滌3次后,浸泡于添加抗生素的PBS中。

長江江豚臍帶細(xì)胞的原代培養(yǎng)(1)組織塊培養(yǎng):將臍帶剪開,使用無菌鑷子剔除臍帶表面的靜脈膜和血塊,使用含100 U/mL青霉素-鏈霉素的PBS溶液多次沖洗,將組織剪成1 mm3左右的方塊,使用15 mL移液管將組織塊均勻分布在10 cm2培養(yǎng)瓶中,滴3滴純胎牛血清,倒置3—4h,再將培養(yǎng)瓶正置并緩緩加入3 mL的完全培養(yǎng)基,完全培養(yǎng)基包含15%FBS、85% DMEM、100 U/mL青霉素-鏈霉素、1×PrimocinTM和5 μg/mL的兩性霉素B。保證組織塊未漂浮,放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱,24h后,加入3 mL培養(yǎng)液(蓋過小的組織塊為準(zhǔn)),每隔3d更換一次培養(yǎng)基。(2)胰酶消化法:臍帶切碎后于0.25%胰蛋白酶,37℃攪拌1h,使用70目的過濾網(wǎng),收集濾后含細(xì)胞的懸液,離心,加入含血清的培養(yǎng)基,重懸于培養(yǎng)皿。

細(xì)胞傳代當(dāng)培養(yǎng)的原代細(xì)胞匯合到80%—90%時,棄培養(yǎng)基,PBS洗滌,添加2 mL的0.25%的胰酶,于培養(yǎng)箱內(nèi)消化約10min,待大部分細(xì)胞變圓漂浮脫壁,加入4 mL含15%的FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器吹打細(xì)胞至游離的懸浮細(xì)胞,按照1﹕3比例傳入培養(yǎng)皿,繼續(xù)培養(yǎng),等細(xì)胞匯合到80%—90%時,進行下一輪傳代。

細(xì)胞純化臍帶組織分離出的細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞對于胰酶的敏感度存在差異,成纖維細(xì)胞易消化漂浮,內(nèi)皮細(xì)胞對胰酶敏感度較差后被消化,成纖維細(xì)胞貼壁較快,生長速度較快,3—5次傳代后,即為成纖維細(xì)胞。

細(xì)胞永生化和鑒定在第5代原代細(xì)胞達到70%—80%匯合時,進行轉(zhuǎn)染實驗。在2個1.5 mL管中分別加入200 μL未添加抗生素以及血清的DMEM培養(yǎng)基,按照DNA﹕轉(zhuǎn)染試劑為1﹕2的比例進行添加,一管加入pW2-Tt-SV40 T antigens 即包裝SV40 LT antigens(Large T-antigen)和ST(Small T-antigen)的表達質(zhì)粒20 μg,一管加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 Reagent 40 μL,5min之后,將兩者混勻,20min之后,將混合液添加到10 cm2培養(yǎng)皿。12h后,更換1/3的培養(yǎng)液,24h后,更換1/3的培養(yǎng)液。36h后,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進行傳代。并根據(jù)已建立的方式[26],進行永生化細(xì)胞系中SV40T表達,以原代細(xì)胞作為對照,取永生化后15代細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,PCR檢測SV40 LT和SV40 ST的表達。使用引物見表1。擴增程序設(shè)定為:98℃ 5min預(yù)變性;98℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 15s,35個循環(huán);72℃延伸5min。

表1 檢測SV40 T antigens的小T抗原和大T抗原區(qū)域的引物列表Tab.1 PCR primers used to amplify the ST and LT region of SV40 T antigens

永生化后的細(xì)胞凍存與復(fù)蘇(1)取第12代、第15代 和第17代匯合度為85%—95%的細(xì)胞,吸除培養(yǎng)液,PBS清洗1次,加入2 mL 0.25%胰酶,待細(xì)胞懸浮為單個游離細(xì)胞,加入2 mL含有血清的培養(yǎng)基,吹勻并移至15 mL離心管,1000 r/min離心5min,棄上清,加入細(xì)胞凍存液后重懸細(xì)胞,稀釋細(xì)胞濃度至5×106個/mL,分裝1 mL至凍存管中,冰上放置30min,-70℃凍存過夜,次日做好相應(yīng)標(biāo)記放入液氮保存,利用臺盼藍(lán)拒染法[26]對凍存的細(xì)胞活性檢測。按照細(xì)胞存活率=活細(xì)胞/(活細(xì)胞+死細(xì)胞)×100%,計算細(xì)胞存活率。(2)從液氮中取出凍存的細(xì)胞,37℃解凍,將凍存細(xì)胞移至15 mL離心管中,1000 r/min 離心5min,棄上清,用10 mL含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后,傳代,利用臺盼藍(lán)拒染法對復(fù)蘇后的細(xì)胞活性檢測。按照細(xì)胞存活率=活細(xì)胞/(活細(xì)胞+死細(xì)胞)×100%,計算細(xì)胞存活率。

CCK-8(Cell counting kit-8)比色法檢測永生化后的細(xì)胞生長曲線取指數(shù)生長的長江江豚臍帶細(xì)胞接種于96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞懸液,設(shè)置5個重復(fù)孔,細(xì)胞接種密度為2.5×104cell/mL,每孔加入10 μL CCK試劑,培養(yǎng)箱孵育4h后,利用酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度(A450),以時間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制永生化后的長江江豚的細(xì)胞生長曲線。

熒光報告基因轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞為了檢驗外源基因在永生化細(xì)胞系內(nèi)的表達情況,接種細(xì)胞于免疫熒光專用共聚焦培養(yǎng)皿10 mm培養(yǎng)皿,參照Lipofectamine 3000說明書,在1.5 mL EP管中使用100 μL培養(yǎng)基(Gibco 公司)稀釋2 μL Lipofectamine 3000 Reagent;另一個EP管中使用100 μL未加血清,抗生素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)稀釋1 μg 質(zhì)粒DNA pEGFP-C1或pERed2-N1。室溫靜置5min后,將兩種溶液混合均勻,制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,室溫孵育20min后,均勻滴至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h和60h的熒光表達,并計算轉(zhuǎn)染效率。

統(tǒng)計學(xué)方法對于CCK-8細(xì)胞增殖實驗,每組實驗設(shè)置5個重復(fù)組,使用GraphPad prism7軟件計算每組吸光度的平均值并繪制細(xì)胞生長曲線。對于熒光報告基因轉(zhuǎn)染效率,分別找出3個合適視野,數(shù)出白光條件下的細(xì)胞數(shù)量和激發(fā)光條件下發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)量,按照轉(zhuǎn)染率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%,計算轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果

2.1 長江江豚臍帶組織原代培養(yǎng)

(1)15d左右組織塊出現(xiàn)細(xì)胞分離,遷出的細(xì)胞圍繞組織塊呈放射狀,細(xì)胞堆積過多時,傳代。一旦組織塊向外遷移細(xì)胞已形成,取出組織塊,轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中,重新接種。接種于培養(yǎng)瓶瓶角的組織塊,細(xì)胞向外遷移速度和效率高于培養(yǎng)瓶中部的組織塊。放置一塊酒精消毒的蓋玻片于組織塊邊緣,可加快組織塊的黏附和細(xì)胞遷移,10—12d可見細(xì)胞遷移。(2)使用0.25%胰酶消化法得到的懸液雜質(zhì)太多,細(xì)胞貼壁少,增加胰酶處理時間,細(xì)胞貼壁數(shù)量增加,細(xì)胞未能傳代。

2.2 長江江豚成纖維細(xì)胞的生長特征和形態(tài)學(xué)觀察

在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱通過原代、傳代培養(yǎng),獲得純化的長江江豚成纖維細(xì)胞。長江江豚細(xì)胞接種至培養(yǎng)基0.5h開始貼壁,細(xì)胞貼壁較牢,多次沖洗也難以脫落,胰酶處理時間久,貼壁細(xì)胞呈鋪石狀,典型的梭形、不規(guī)則或多邊形,細(xì)胞體積較小,邊界清楚,核仁清晰(圖1)。

2.3 長江江豚臍帶成纖維細(xì)胞永生化

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將SV40 T antigens轉(zhuǎn)染到長江江豚第三代原代細(xì)胞中。10 cm2細(xì)胞皿接種不多于2×105cell/mL,pW2-SV40 T antigens質(zhì)粒為20 μg。轉(zhuǎn)染SV40 T antigens后,12h后部分細(xì)胞死亡,轉(zhuǎn)入SV40 T antigens的細(xì)胞會形成一個細(xì)胞灶,生長加速,占據(jù)優(yōu)勢,36h后,可傳代。從細(xì)胞傳代和細(xì)胞增殖能力可以判斷有部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功,少量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞快速增殖,占據(jù)優(yōu)勢。原代的臍帶細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長速度變慢,14代細(xì)胞已經(jīng)老化,死亡,沒法傳代(圖2a)。相比較原代細(xì)胞,永生化的細(xì)胞生長狀態(tài)良好,生長速度明顯加快,體外可穩(wěn)定傳代40代以上,且增殖能力方面也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原代細(xì)胞,說明永生化成功。對于快速增殖的細(xì)胞系,選取擴增了15代和20代的細(xì)胞系,以原代細(xì)胞作為對照,通過PCR來進行鑒定,結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系中檢測到SV40 T antigens的大T和小T抗原區(qū)域的表達(圖3),表明SV40 LT antigens已經(jīng)在細(xì)胞中整合。永生化的細(xì)胞若未及時傳代,細(xì)胞會出現(xiàn)老化和生長衰退(圖2b)。

圖1 長江江豚原代成纖維細(xì)胞和永生化細(xì)胞(×10物鏡)Fig.1 The primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

圖2 長江江豚原代成纖維細(xì)胞老化細(xì)胞(a)和永生化老化細(xì)胞(b)(×10物鏡)Fig.2 The cellular aging of primary cultured fibroblasts Yangtze finless porpoise(a)and immortalized fibroblasts(b)(×10 objective)

2.4 永生化后長江江豚臍帶細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后的活率

選取永生化后第12代、第15代和第17代江豚成纖維細(xì)胞,對凍存前及復(fù)蘇后的細(xì)胞進行細(xì)胞重懸,制備細(xì)胞懸液,滴加染料,靜置時間1—2min,計著色細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),制表。由表2可知,復(fù)蘇24h,細(xì)胞凍存復(fù)蘇率達到90%,凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好,復(fù)蘇之后,細(xì)胞狀態(tài)良好,活力并未有太大改變,不同代數(shù)之間無明顯差異。

2.5 永生化后的細(xì)胞生長曲線

將永生化后江豚成纖維細(xì)胞按2.5×104cell/mL接種于96孔板連續(xù)培養(yǎng),利用CCK-8法,每12h測量并記錄波長在450 nm處的吸光值,繪制了長江江豚成纖維細(xì)胞生長曲線(圖4),永生化的成纖維細(xì)胞生長曲線呈“S”型,培養(yǎng)1—2d時,細(xì)胞數(shù)量沒有較大變化,此時細(xì)胞處于潛伏期;培養(yǎng)3d后細(xì)胞開始快速生長,此時進入對數(shù)生長期;培養(yǎng)6d時細(xì)胞生長開始減緩;培養(yǎng)7—8d時,細(xì)胞數(shù)量基本維持不變,此時細(xì)胞生長進入平臺期。

2.6 長江江豚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000將編碼紅色熒光蛋白的質(zhì)粒 pERed2-N1和編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染至長江江豚的臍帶成纖維細(xì)胞,檢測外源基因轉(zhuǎn)染入長江江豚細(xì)胞內(nèi)的基因表達情況。熒光蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有穩(wěn)定表達,細(xì)胞核的熒光強度高于細(xì)胞質(zhì)。轉(zhuǎn)染24h僅有少量的細(xì)胞能夠表達熒光蛋白,48h可觀察到較多熒光蛋白,60h可觀察到更高密度和亮度的熒光蛋白(圖5),轉(zhuǎn)染效率不到15%,這表明長江江豚細(xì)胞使用質(zhì)粒進行基因的過表達效率較低。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前有所不同,有拉長變細(xì)的趨勢,細(xì)胞變?yōu)閳A球狀,懸浮狀,細(xì)胞碎片較多,完整細(xì)胞核仁明顯。

圖3 PCR檢測SV40 LT和ST基因Fig.3 Detection of SV40 LT and SV40 ST transcript by PCR

表2 長江江豚不同世代成纖維細(xì)胞凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞活率Tab.2 The survival rate before and after cryopreservation of Yangtze finless porpoise fibroblasts at different passages

3 討論

3.1 構(gòu)建穩(wěn)定長江江豚細(xì)胞系的意義

長江江豚屬于國家級保護動物,因為倫理和法律的原因,對動物機體造成損傷的研究無法開展,生理問題的分子機制仍然知之甚少。細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,在一定培養(yǎng)條件下可視為生命活動的縮影,細(xì)胞生物學(xué)的先行者Wilson指出:“每一個生物學(xué)問題的關(guān)鍵最終必然從細(xì)胞中尋找”。建立穩(wěn)定的長江江豚細(xì)胞系,便于利用影像技術(shù)進行形態(tài)結(jié)構(gòu)分析,使用分子、生化、免疫技術(shù)進行物質(zhì)變化檢測,為細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等提供穩(wěn)定均一的研究樣品。對江豚敏感病毒培養(yǎng)和鑒定,從微觀上對江豚的個體致疾、致危、致死因素及機制的了解提供基礎(chǔ)。此外,構(gòu)建穩(wěn)定長江江豚細(xì)胞系,可以更好地將先進分子技術(shù)手段運用于長江江豚的疾病治療、飼養(yǎng)繁殖等工作中。

3.2 影響長江江豚臍帶原代細(xì)胞培養(yǎng)的因素

組織塊培養(yǎng)和酶消化法是目前最常見的體外細(xì)胞培養(yǎng)方法[27]。組織塊操作簡便,對細(xì)胞傷害較小,但是細(xì)胞游離出來易堆積,生長周期長[28];酶消化法操作復(fù)雜,但是獲得細(xì)胞快速,細(xì)胞多單個或成團,很少成片[29],主要包括中性蛋白酶+膠原酶消化法和胰蛋白酶消化兩種方法[30—32]。

圖4 長江江豚臍帶成纖維細(xì)胞生長曲線Fig.4 The growth curve of Yangtze finless porpoise fibroblasts

組織貼壁法,除了新鮮組織外,最為關(guān)鍵是貼壁方法、時間和組織塊的大小。高效的貼壁方法是組織原代培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。貼壁方法可采用培養(yǎng)瓶倒置-正置法,將組織塊均勻鋪在培養(yǎng)瓶中,滴1—2滴純的胎牛血清于組織塊,倒置培養(yǎng)瓶,待貼壁后,正置培養(yǎng)皿,添加培養(yǎng)基;貼壁時間過長,組織塊易變質(zhì),過短加培養(yǎng)基易漂浮,3—4h即可;組織塊最適大小約1 mm3,鋪盤時組織塊密度需適中。組織類型不同,組織塊游離出細(xì)胞的時間不同,大鼠成骨細(xì)胞約3d就從組織塊游離[33],驢皮成纖維細(xì)胞約15d游離形成原代細(xì)胞[34],江豚臍帶成纖維細(xì)胞約14d組織附近游離出細(xì)胞。

圖5 脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-C1和pERed2-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染長江江豚永生化細(xì)胞(A.比例尺25 μm;B.比例尺75 μm）Fig.5 Liposome-medicated transfection of plasmids pEGFP-C1 and pERed2-N1 intoYangtze finless porpoise fibroblasts(A.Scale bar 25 μm;B.Scale bar 75 μm)

長江江豚的臍帶產(chǎn)出需要6—8h,水中浸泡,導(dǎo)致雜菌污染,原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加兩性霉素B和PrimocinTM,可提高原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。

3.3 永生化的長江江豚細(xì)胞生物學(xué)特征

江豚原代成纖維細(xì)胞在體外的生長速度,隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加明顯延長,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,細(xì)胞間隙增大。永生化后的成纖維細(xì)胞,經(jīng)多次細(xì)胞傳代后細(xì)胞形態(tài)和狀態(tài)相對穩(wěn)定,但細(xì)胞也會出現(xiàn)老化和衰退。

3.4 影響細(xì)胞永生化的因素

有限的細(xì)胞系,體外多次傳代易發(fā)生遺傳性狀的改變,小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞通常只能良好生長5代,5代之后的細(xì)胞急劇衰亡[35]。家兔胚胎成纖維細(xì)胞在10代以后出現(xiàn)衰老跡象,胞體平鋪,偽足增多,生長速度慢[36]。臍帶細(xì)胞難以培養(yǎng),一般只能傳2—3代,添加L-谷氨酰胺可讓人的臍帶靜脈細(xì)胞傳至6—7代[37]。利用SV40 T antigens,建立可傳代培養(yǎng)25代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞系[38]。對于SV40 T antigens誘發(fā)的永生化,SV40 T antigens的用量、質(zhì)粒的濃度和純度對于轉(zhuǎn)染是否成功有很重要的意義,合適的用量、高濃度高純度的SV40 T antigens成功概率更大。對于長江江豚細(xì)胞系,除脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染外,可使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、慢病毒和腺病毒感染等多種方式進行外源基因的過表達或干擾來進行某個基因功能的研究。

鯨類由于物種的特殊性,成功建立的鯨類永生化的細(xì)胞系甚少,淡水鯨類細(xì)胞系的相關(guān)研究更是寥寥無幾,臍帶作為連接母、胎之間的紐帶,對于我們了解母、胎之間的物質(zhì)運輸具有重要意義,本實驗借助長江江豚分娩時產(chǎn)出的臍帶,成功進行體外培養(yǎng),并且成功構(gòu)建了永生化的臍帶成纖維細(xì)胞系,驗證了江豚分娩8h后產(chǎn)出的臍帶及胎盤的活性,對長江江豚臍帶的體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性進行了初步探索,旨在為長江江豚的體外培養(yǎng)建立一些細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù),奠基后續(xù)胎盤研究以及臍帶血的研究,為本物種其他組織體外穩(wěn)定建系打下基礎(chǔ),僅為其他難以建立的豚類細(xì)胞系提供參考。

4 展望

隨著海洋研究的深入,分子和生化技術(shù)越來越多的應(yīng)用到鯨類研究中,構(gòu)建鯨類穩(wěn)定的細(xì)胞系是必然的發(fā)展方向。鯨類作為特殊的二次入水的動物,越來越多的證據(jù)表明,鯨類在長期的演化過程中,產(chǎn)生了自己獨特的適應(yīng)機制。而長江江豚作為特殊的淡水豚類,可能存在一些不同于海洋豚類的適應(yīng)機制,而對這些適應(yīng)機制和相關(guān)基因的的研究必然要到細(xì)胞中去尋找答案。