徐顯睿，李翠鳳，張宗博，謝璐璐，劉國(guó)強(qiáng)，李敏，趙林水，張?zhí)m威

（1.杭州娃哈哈科技有限公司，杭州310018；2.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)食品實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266000；3.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266000）

0 引言

益生菌除調(diào)節(jié)腸道健康[1-3]和提高免疫力[4-6]外，還可緩解兒童輪狀病毒、抗生素相關(guān)腹瀉[7-8]、便秘[9]，改善骨質(zhì)疏松[10]、焦慮抑郁[11]、過(guò)敏性鼻炎[12]，降低血糖[13]，控制體重[14]，抑制炎癥等[15]，并且有研究表明對(duì)益生菌功效研究主要集中在嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌[16]，益生菌在產(chǎn)業(yè)化和生產(chǎn)流通中，需能保證有效菌數(shù)，較好穩(wěn)定性，并保持活性和益生特性[17]，但在生產(chǎn)中存在菌株衰退導(dǎo)致生物學(xué)性狀發(fā)生改變[18]，且產(chǎn)業(yè)化后菌株功效驗(yàn)證往往復(fù)雜和嚴(yán)格，因此將菌株能否保持篩選時(shí)益生特性及遺傳穩(wěn)定性作為可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的首要條件和標(biāo)準(zhǔn)[19]。這是因?yàn)檫B續(xù)傳代和轉(zhuǎn)管次數(shù)可導(dǎo)致基因重排或缺失，影響其益生特性[20-23]。

本研究中菌株是經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，具有優(yōu)良益生特性[24]。通過(guò)評(píng)價(jià)益生性狀遺傳性及貨架期存活率，篩選益生特性最佳菌株，旨在為益生菌產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38，Z-39，長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47，由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)公司食品菌株資源庫(kù)提供；鼠李糖乳桿菌LGG購(gòu)于新西蘭恒天然公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)公司）；濃鹽酸、NaCl、NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、氯仿、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；厭氧培養(yǎng)罐AG050型，廣州雷得生物技術(shù)有限公司；電子天平SE6001FZH，美國(guó)奧豪斯公司；1-7離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；p H計(jì)PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計(jì)756PC型，上海光譜儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋渦振蕩器MX-S型，美國(guó)賽洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株連續(xù)傳代

將供試菌株原始保藏菌種劃線于固體MRS培養(yǎng)基上，復(fù)壯2代，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形態(tài)選取3個(gè)單菌落分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中（雙歧桿菌添加L-半胱氨酸鹽酸鹽），37℃恒溫培養(yǎng)16 h，作為連續(xù)傳代的初始菌株。為保證菌株遺傳穩(wěn)定，選擇穩(wěn)定期進(jìn)行菌株連續(xù)傳代，上述菌株培養(yǎng)12 h均處于穩(wěn)定期，因此以12 h為1個(gè)傳代周期，連續(xù)傳代6次，獲得傳代菌液，備用。

1.3.2 菌體制備

按1.3.1中方法獲得不同菌株傳代4，5，6次菌液；4℃，8 000g條離心10 min，收集菌體。用p H值為6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，再用4～8 mL無(wú)菌PBS將菌體重懸，備用。

1.3.3 菌株耐模擬胃酸和腸液能力測(cè)定

按1.3.1中方法獲得傳代4，5，6次菌液；在4℃，4 000g條件下離心10 min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌2次，等體積重懸于人工胃液或腸液，在模擬胃液中孵育15，30，60 min（在人工腸液中孵育5 h），取重懸液稀釋后傾注于MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以鼠李糖乳桿菌LGG作為對(duì)照，分別計(jì)算連續(xù)傳代4、5、6代各菌株存活率，存活率為

式中：B0為菌懸液初始菌數(shù)；B1為人工胃液或腸液處理后菌懸液菌數(shù)。

1.3.4 菌株靜電作用率測(cè)定

以氯仿為路易斯酸，用p H值為6.8的PBS將

1.3.2 中菌懸液OD600調(diào)至0.6，加入1 mL氯仿，靜置5 min后充分震蕩120 s，再靜置10 min取水相，以鼠李糖乳桿菌LGG為對(duì)照，用石英比色杯測(cè)定OD600nm，疏水率為：

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置10 min后水相OD600nm。

1.3.5 菌株自凝集率測(cè)定

用p H值為6.8的PBS將1.3.2中菌懸液OD600調(diào)至0.6，于37℃靜止放置2 h。以鼠李糖乳桿菌LGG作為對(duì)照，測(cè)定上層液體OD600nm，自凝集率為

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置后菌懸液上層液體OD600nm。

1.3.6 菌粉貨架期活菌數(shù)測(cè)定

按1.3.1中方法將不同菌株傳代4，5，6次菌液制成菌粉，取1 g稀釋菌粉裝于雙層鋁箔袋中，密封，放置于25和-20℃條件下保存，分別于0，15，30，45，60，75，90 d取樣測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.7 活菌數(shù)測(cè)定參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同代數(shù)耐模擬胃液測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，不同菌株傳代4次對(duì)模擬胃液耐受性不同，嗜酸乳桿菌Z-43、長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5、短雙歧桿菌Z-47對(duì)模擬胃液耐受性最差，孵育15 min無(wú)活菌存活。乳雙歧桿菌Z-1對(duì)模擬胃液耐受性最好，在模擬胃液中孵育60 min的存活率高達(dá)93.07%，其次為乳雙歧桿菌Z-36和Z-38，在模擬胃液中孵育60 min的存活率分別為65.66%和22.64%。乳雙歧桿菌Z-39在模擬胃液中孵育30 min存活率為58.79%，對(duì)模擬胃液耐受性一般，但較對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG均表現(xiàn)出更好的胃酸耐受能力。

圖1菌株傳代4次對(duì)模擬胃液耐受性

由圖2和圖3看出，相對(duì)于4次傳代，菌株經(jīng)5，6次傳代對(duì)模擬胃液耐受性均呈下降趨勢(shì)，且孵育時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)模擬胃液耐受性越差。乳雙歧桿菌Z-1傳代5次在模擬胃液中孵育15，30，60 min較4次傳代；耐受性分別降低31.56%，26.74%，56.27%；但與傳代6次在模擬胃液中孵育15，30，60 min存活率基本一致，分別為70.36%，68.26%，36.8%和68.16%，67.77%，41.76%。乳雙歧桿菌Z-36和Z-38連續(xù)傳代對(duì)模擬胃液耐受性變化趨勢(shì)與乳雙歧桿菌Z-1類似，傳代5和6次對(duì)模擬胃液耐受性變化不顯著，較4次傳代耐不同時(shí)間模擬胃液能力分別降低約16.14%，44.77%，37.42%和23.9%，7.59%，18.14%。乳雙歧桿菌Z-39連續(xù)傳代對(duì)模擬胃液中孵育15 min的存活率無(wú)影響，孵育30 min存活率由58.79%降低至2.68%。對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG經(jīng)連續(xù)傳代對(duì)模擬胃液耐受性由19.83%降低至11.2%，變化趨勢(shì)不顯著，可能與鼠李糖乳桿菌LGG具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳特性有關(guān)，也可能因?yàn)榫瓯旧砟湍M胃液的能力較差。因此綜上所述，4次傳代的乳雙歧桿菌Z-1表現(xiàn)為最佳耐胃酸菌株。

圖2菌株傳代5次對(duì)模擬胃液耐受性

圖3菌株傳代6次對(duì)模擬胃液耐受性

2.2 不同代數(shù)耐模擬腸液測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，菌株傳代不同次數(shù)對(duì)模擬腸液的耐受性不同。嗜酸乳桿菌Z-43、乳雙歧桿菌Z-38和Z-39傳代4，5，6次對(duì)模擬腸液耐受能力基本一致，甚至有上升趨勢(shì)。其中乳雙歧桿菌Z-39傳代6次對(duì)模擬腸液耐受性為96.94%，提高約20%。嗜酸乳桿菌Z-43傳代5，6次耐模擬腸液能力較傳代4次提高8.83%和5.24%，分別為40.56%和36.97%。對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG經(jīng)連續(xù)傳代提高約1.99%，上述菌株在該特性方面表現(xiàn)出較好的遺傳穩(wěn)定性。乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47連續(xù)傳代對(duì)模擬腸液耐受性呈逐漸降低的趨勢(shì)，降低18.34%~36.57%。因此綜上所述，傳代4，5，6次對(duì)嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-38和Z-39耐模擬腸液能力無(wú)影響，而其他菌株傳代4次則表現(xiàn)為菌株自身最佳耐腸液能力。

圖4菌株傳代不同次數(shù)對(duì)模擬腸液耐受性

2.3 不同代數(shù)靜電作用率測(cè)定結(jié)果

乳酸菌在腸道中以特異性和非特異性兩種方式黏附于小腸黏膜，非特異性作用方式主要與靜電作用率有關(guān)[25]。由圖5可知，菌株傳代不同次數(shù)對(duì)菌株表面攜帶產(chǎn)生靜電作用的電荷量不同。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38，對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG傳代4，5，6次對(duì)氯仿的靜電作用率差異不顯著，差異在0.77%~9.74%；乳雙歧桿菌Z-39，長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47隨傳代次數(shù)增加，靜電作用率逐漸減弱，其中乳雙歧桿菌Z-39經(jīng)6次傳代，其對(duì)氯仿靜電作用率降低最大，約34.12%。因此綜上所述，嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38連續(xù)傳代6次靜電作用率基本相同，其他菌株傳代4代靜電作用率最大。

圖5菌株傳代不同次數(shù)靜電作用率測(cè)定結(jié)果

2.4 不同代數(shù)自凝集率測(cè)定結(jié)果

乳酸菌的高自聚率有利于其在小腸黏膜上定植[26]。由圖6可知，菌株傳代不同次數(shù)自凝集率不同。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，短雙歧桿菌Z-47連續(xù)傳代6次自凝集率基本一致；其中菌株Z-1，Z-36，Z-47自凝集率有0.64%~4.23%提高，它們與對(duì)照菌株鼠李糖乳桿菌LGG在自凝集率方面均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定遺傳能力，其他菌株傳代6次自凝集率較4代傳代則降低4.71%~10.55%。

圖6菌株傳代不同次數(shù)自凝集率測(cè)定結(jié)果

2.5 不同代數(shù)、溫度貨架期菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

由圖7可知，菌株傳代不同次數(shù)制備菌粉在25℃（90 d）貨架期菌數(shù)存活率不同，嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36在貨架期菌數(shù)存活率及遺傳穩(wěn)定性方面表現(xiàn)最好。嗜酸乳桿菌Z-43傳代4次在15，30，45，60，75，90 d菌 數(shù) 存 活 率 分 別 為80.34%，71.88%，66.86%，66.29%，69.38%，57.43%；與傳代5，6次菌數(shù)存活率變化曲線一致。傳代5次在90 d菌數(shù)存活率為55.92%，較4次傳代有較好遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)傳代6次在90 d菌數(shù)存活率為41.84%，降低約14.84%，差異不顯著。乳雙歧桿菌Z-1和Z-36傳代4，5，6次貨架期菌數(shù)變化趨勢(shì)基本相同，且遺傳穩(wěn)定性均較好；在15，30，45，60，75，90 d菌 數(shù) 存 活 率 分 別 為91.54%~107.88%，79.45%~84.27%，50.77%~66%，39.33%~56.79%，30.31%~40.86%，25.82%~30.10%和88.81%~95%，73.23%~76.74%，47.75%~54.67%，35.6%~36.86%，27.30%~28.72%，22.5%~24.11%。

圖7 25℃菌粉貨架期活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5貨架期菌數(shù)存活率遺傳穩(wěn)定性較好，但貨架期菌數(shù)穩(wěn)定性較上述菌株偏低，15 d存活率僅為37.27%，但90 d存活率約為23.16%，說(shuō)明該菌株在前期衰減速度較快，而在后期相對(duì)穩(wěn)定，這種變化趨勢(shì)與短雙歧桿菌Z-47相類似。其他菌株隨著連續(xù)傳代貨架期菌數(shù)存活率呈明顯下降趨勢(shì)，如乳雙歧桿菌Z-38傳代6次在45 d存活率較4次傳代下降約19%（60 d）下降約12.95%。其中乳雙歧桿菌Z-39貨架期菌數(shù)及遺傳穩(wěn)定性最差，傳代6次在90 d存活率顯著減低，僅為0.37%。

圖8-20℃菌粉貨架期活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

由圖7和圖8可以看出，菌株傳代不同次數(shù)制備菌粉在-20℃（90 d）貨架期菌數(shù)存活率較25℃條件下顯著提高，并且穩(wěn)定性更好，此外菌株連續(xù)傳代表現(xiàn)的遺傳穩(wěn)定性也更好。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36經(jīng)連續(xù)傳代在90 d菌數(shù)存活率均在90%以上；其他菌株經(jīng)連續(xù)傳代各代間菌數(shù)存活率基本一致，在-20℃（90 d）存活率在40%左右。其中短雙歧桿菌Z-47傳代6次在90 d菌數(shù)存活率為23.4%，較傳代4，5次降低約10%。因此綜上所述，以菌數(shù)穩(wěn)定性指標(biāo)考慮，嗜酸乳桿菌Z-43，短雙歧桿菌Z-47傳代5次，長(zhǎng)雙歧桿菌Z-5，乳雙歧桿菌Z-1和Z-36傳代4，5，6次其貨架期穩(wěn)定性最好；而乳雙歧桿菌Z-38，Z-39傳代4次為最佳。另外在產(chǎn)業(yè)化中將菌粉用載體稀釋并采用充氮包裝形式可改善菌粉貨架期穩(wěn)定性[21,27]。

3 結(jié)論

對(duì)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行連續(xù)傳代，分別測(cè)試傳代4、5、6次菌株對(duì)模擬胃液和腸液的耐受性，并以靜電作用率和自凝集率指標(biāo)評(píng)價(jià)不同代數(shù)菌株黏附性，再分別考察菌株傳代不同代數(shù)制成菌粉在25、-20℃條件下保藏90 d的菌粉穩(wěn)定性。結(jié)果表明嗜酸乳桿菌Z-43連續(xù)6次傳代其靜電作用率約為100%，在25和-20℃條件下90 d菌數(shù)存活率穩(wěn)定在60%和90%以上，具有極好遺傳穩(wěn)定性，黏附性和貨架期穩(wěn)定性。其中乳雙歧桿菌Z-1傳代4次在模擬胃液、模擬腸液中分別孵育60 min和5 h的存活率為93.07%和106.5%，對(duì)氯仿靜電作用率為97.35%，表明其腸道定植能力較好。在25和-20℃條件下90 d菌數(shù)存活率分別為30.10%和92%，穩(wěn)定性較好，表現(xiàn)為最佳抗性菌株。因此在后續(xù)菌粉產(chǎn)業(yè)化中，需對(duì)嗜酸乳桿菌Z-43凍干保護(hù)劑和產(chǎn)品劑型重點(diǎn)研究，提高菌劑對(duì)胃酸的耐受性。對(duì)于乳雙歧桿菌Z-1則需重點(diǎn)關(guān)注菌種保藏、活化次數(shù)，防止其益生性狀衰退。