張 雯, 王建軍, 房茹茹, 黨苗苗

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

酸乳具有調節(jié)人體腸道中微生物菌群平衡、促進鈣、鎂、單糖等吸收、控制體內毒素、改善肝功能等作用，同時以其獨特的營養(yǎng)和風味風靡全世界[1].但制備過程中脂肪上浮和蛋白質沉淀問題一直制約著其產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)[2]，目前已成為酸乳制備工藝的研究熱點，將膳食纖維作為穩(wěn)定劑加入其中是解決方案之一，國內外已經(jīng)做了一些研究.

細菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)是由微生物合成的、由吡喃葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子聚合物，呈現(xiàn)獨特的三維網(wǎng)狀結構[3].作為膳食纖維，BC可改善糖代謝，對糖尿病患者血糖控制具有積極作用[4]；對高脂肪膳食引起的肝脂肪病變有阻抑作用[5]，能夠起到預防脂肪肝的作用；BC獨特的三維網(wǎng)狀結構使其具有增稠、乳化等作用，影響食品分子結構、膠凝和粗度，可作為穩(wěn)定劑部分替代酸乳中外源添加的穩(wěn)定劑，減少食品添加劑的使用，降低成本.

將BC與酸乳結合制備新型膳食纖維酸乳，有望改善酸乳脂肪上浮和蛋白質沉淀的問題，同時使酸乳產(chǎn)品進一步功能化.該類產(chǎn)品的開發(fā)可豐富酸乳市場產(chǎn)品類型，促進BC在食品行業(yè)的應用.文獻[6-16]從不同方面報道了果膠作為復配劑或單獨使用對乳體系相分離及穩(wěn)定性的影響研究，為不同食品添加劑在酸奶中的應用提供一定的理論支持和技術參考.田芬等[17]表明水溶性膳食纖維能夠增大體系的粘度和粒度.Jagannath等[18]表明BC或Nata可以為乳酸菌發(fā)酵過程提供支持.

本文以新鮮生牛乳為原料，添加BC制備新型膳食纖維酸乳，旨在改善酸乳產(chǎn)品蛋白質沉淀的問題.研究了BC酸乳發(fā)酵過程中發(fā)酵乳含量、BC添加量、復配穩(wěn)定劑種類及含量等因素對BC酸乳的影響及環(huán)境應力對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響.本研究所制備BC酸乳具有更好的營養(yǎng)和保健功能，且能夠減少酸乳飲料生產(chǎn)過程中穩(wěn)定劑的使用.該研究為功能性食品的進一步開發(fā)打下了良好的基礎.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

生牛乳，陜西科技大學沁園餐廳提供；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，ST)、 保加利亞桿菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)、木糖葡糖酸醋桿菌(Acetobacterxylinum) ，陜科大實驗室分離保藏 ；其余試劑均為市售分析純或生化試劑.

種子培養(yǎng)基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氫二鈉4～5 g/L，檸檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氫二鈉4～5 g/L，檸檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

1.1.2 主要儀器

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱，上海百典儀器設備有限公司；YP402N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；RE52CS-1型zeta電位儀，上海亞榮生化儀器廠；S-4800型掃描電鏡，日立高新科技國際貿易有限公司；TDL-40B型高速離心機，上海安亭科學儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 BC制備

將木糖葡糖酸醋桿菌(Acetobacterxylinum)活化，擴大培養(yǎng)，得種子液，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下發(fā)酵10 d，將發(fā)酵液液面上層的BC膜取出水洗，80 ℃下，1.0%～1.5% NaOH溶液中浸泡30 min，水洗至BC膜呈透明狀，在110 ℃下干燥，得到BC，再將BC勻漿(15 000 r/min，4 min)可得絮狀BC.

1.2.2 酸乳制備

移取15 mL新鮮生牛乳于厭氧管中， 95 ℃滅菌20 min，冷卻后分別按5%接種量接種LB和ST，45 ℃培養(yǎng)3 h，得發(fā)酵劑.取150 mL脫脂鮮牛乳置于250 mL藍口瓶中，加入2%蔗糖，封裝殺菌，按總接種量10%接入發(fā)酵劑(LB∶ST=1∶1)，45 ℃發(fā)酵4 h得發(fā)酵乳.發(fā)酵乳經(jīng)攪拌(15 000 r/min,10次,15 min)得中間乳，將絮狀BC加入中間乳中，經(jīng)均質(400 Pa,10次)、后熟(4 ℃，12 h)得BC酸乳成品.

1.2.3 BC酸乳制備工藝優(yōu)化

選10名有經(jīng)驗的品嘗人員對產(chǎn)品進行品嘗，采用100分制評分法，從組織狀態(tài)、沉淀析出情況、口感、風味四個方面進行感官評價(表1)[19]，以BC酸乳分層時間和感官評價分數(shù)為評價指標，分別對發(fā)酵乳含量(30%、35%、40%、45%、50%)、BC添加量(2.5%、3%、3.5%、4%、6%)、CMC/黃原膠(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 )進行單因素實驗，確定各因素對BC酸乳制備的影響及其適宜水平.

根據(jù)單因素實驗結果，選擇對BC酸乳制備影響較大的因素進行正交試驗,以感官評分及分層時間為考核指標，確定BC酸乳制備最優(yōu)工藝.采用酸堿滴定法測定所制備BC酸乳酸度；采用PHS-2 酸度計測定pH；采用平板法測定活菌數(shù).

表1 BC酸乳感官評分標準

1.2.4 BC酸乳形貌表征

將BC酸乳儲存于冷藏柜中，觀察其凝乳狀態(tài)；對BC及BC酸乳冷凍干燥后噴金處理，利用 SEM 觀察其微觀形貌.

1.2.5 BC酸乳的穩(wěn)定性能

(1)環(huán)境應力對BC酸乳穩(wěn)定性的影響

制備BC酸乳，將其稀釋至不同質量濃度(5%、10%、15%)，分別測定其在不同pH(3、4、5、6、7、8)，NaCl溶液(50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L)和溫度(0、30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃)下的沉淀率，研究環(huán)境應力對BC酸乳穩(wěn)定性的影響.沉淀率采用以下方法進行測定：取10 mL BC酸乳，質量記為W1，3 000 r/min離心10 min，傾去上層清夜，將沉淀物在100 ℃下烘干60 min，質量記為W2可采用公式(1)計算BC酸乳沉淀率：

(1)

(2)環(huán)境應力對BC酸乳δ電位的影響

分別取50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L NaCl溶液，稀釋BC酸乳至1%，室溫下存儲24 h， 3 000 r/min離心10 min，利用zeta電位測定儀測定樣品表面電荷分布情況.每份樣品測定三次，取其平均值.

2 結果與討論

2.1 BC酸乳制備工藝優(yōu)化

2.1.1 BC酸乳制備工藝優(yōu)化單因素實驗

(1)發(fā)酵乳含量對BC酸乳的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵乳含量增大，分層時間及感官評價整體呈現(xiàn)上升趨勢.當發(fā)酵乳含量為30%時，發(fā)酵乳會出現(xiàn)明顯的發(fā)酵香味不足，口感稀薄等問題；當發(fā)酵乳含量達40%時，儲存12天之后出現(xiàn)分層，且感官評價分數(shù)最高，當發(fā)酵乳含量達到更高時，分層時間和感官評級分數(shù)均下降，由此可見發(fā)酵乳含量過高會使得BC與酪蛋白過度結合從而影響互傳三維網(wǎng)狀結構進而導致酸乳穩(wěn)定性降低，且發(fā)酵乳過多會導致一定程度上的乳清分離進而影響酸乳口感.

圖1 發(fā)酵乳含量對BC酸乳的影響

(2)BC添加量對BC酸乳的影響

由圖2可知，2.5%～4%的添加量對酸乳的色澤，凝結狀態(tài)，口感都有較好的影響.隨著BC添加量的增大，當BC添加量為6%時，樣品分層時間與感官評價分數(shù)有所降低，這是由于BC親水基團與酪蛋白結合，對水分的束縛能力加強，因而乳清的析出速率慢.此外，BC添加量為4%的樣品無沉淀析出，酸度適中，口感清爽有酸奶香味，故選取4%作為酸乳的BC添加量.

圖2 BC添加量對BC酸乳的影響

(3)復配穩(wěn)定劑比例對BC酸乳的影響

由圖3可知，以CMC為主體穩(wěn)定劑，分別配以明膠、黃原膠和海藻酸鈉，當CMC與黃原膠復配使用時，酸乳穩(wěn)定性相對較好，且當其比例為1∶2時，穩(wěn)定性效果最佳，CMC與海藻酸鈉復配效果次之，與明膠復配效果最差.

圖3 復配穩(wěn)定劑比例對BC酸乳的影響

2.1.2 BC酸乳制備工藝優(yōu)化正交試驗

設計三因素三水平的正交試驗，試驗設計如表2所示，試驗結果如表3所示.由表3可知，三因素對BC酸乳的影響主次順序為：BC添加量>發(fā)酵乳含量>復配穩(wěn)定劑(CMC/黃原膠總量為0.5%)比例.各因素的最優(yōu)水平是A1B1C1，即BC的添加量為3%、發(fā)酵乳含量為35%、復配穩(wěn)定劑CMC/黃原膠=1∶1，復配穩(wěn)定劑總量為0.5%，如表4所示.在此條件下制備的BC酸乳在4 ℃下貯存33天后開始分層，感官評價分數(shù)為95分，酸度為79 °T，pH為4.62，活菌數(shù)為1.79×108cfu/mL.

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗結果

表4 BC酸乳理化性質

2.2 BC酸乳形貌

2.2.1 BC酸乳表觀形貌

圖4所示為不同BC添加量酸乳外觀形貌.BC酸乳中，BC纖維束通過非共價相互作用附著于酪蛋白上，均勻地分散在蛋白質中，可能是由于在低溫條件下形成大量氫鍵，這使得BC與蛋白質通過良好的網(wǎng)絡互穿作用相互結合，因此所形成的乳液最穩(wěn)定.

由圖4可知，BC酸乳呈現(xiàn)乳白色，未見明顯分層，氣味清香 ，其中，加入4%的BC酸乳外觀穩(wěn)定性最好.未加BC時，酸乳分層時間較快且口感略差；加入2% BC時，其添加量太少，不足以形成強的三維網(wǎng)絡結構來更好的穩(wěn)定酸乳；加入6%的BC時，BC分布不均勻，連續(xù)的蛋白質網(wǎng)絡被破壞，蛋白質和BC發(fā)生聚集，影響酸乳的穩(wěn)定性而導致分層.

圖4 不同BC添加量的酸乳

2.2.2 BC酸乳微觀形貌

對BC微觀形貌進行測定，結果如圖5所示.其中，圖5(a)、(b)為BC的表面形貌SEM， (c)、(d)為斷層形貌SEM.由圖5可知，BC具有典型的三維網(wǎng)狀層狀結構，各纖維絲相互纏繞形成致密的網(wǎng)絡,正是由于其復雜的三維網(wǎng)絡結構可與酪蛋白結合，從而起到穩(wěn)定乳液的作用.

圖6所示為BC酸乳中固形物的微觀形貌.新鮮生牛乳中酪蛋白占牛乳蛋白總量的80%～82%，因此，為解決乳蛋白在酸性條件下的變性沉淀，需研究穩(wěn)定劑與乳蛋白之間的相互作用.將BC作為穩(wěn)定劑加入，其中一部分BC與蛋白質顆粒發(fā)生靜電相互作用同時吸附在蛋白質顆粒的表面，以此來提供空間位阻效應來維持酪蛋白在酸性條件下的穩(wěn)定性；另一部分BC以增加體系粘度的方式減緩酪蛋白的沉降速率.

總體而言，其致密的微觀結構說明了BC氫鍵含量較多且可通過氫鍵作用與蛋白質良好兼容.此外，BC纖維絲束同樣與蛋白質聚集體連接在一起，在酸乳中加入BC也影響了蛋白質的聚集，BC之間形成了三維結構，這種三維網(wǎng)狀結構可以將蛋白質分開來阻止蛋白質的聚集也能夠使蛋白原嵌入其中，這種互穿三維網(wǎng)絡結構更不易聚集形成沉淀.

(a)表面放大5K (b)表面放大50K

(c)斷層放大2K (d)斷層放大10K圖5 BC表面及斷面形貌SEM圖

(a)非BC酸乳微觀放大20 K (b)BC酸乳橫面微觀放大20 K

(c)BC酸乳截面微觀放大20 K (d)BC酸乳微觀放大50 K圖6 BC酸乳的微觀形貌

2.3 BC酸乳穩(wěn)定性能

2.3.1 環(huán)境應力對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(1)pH對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

酪蛋白膠粒之間有三種作用力，即范德華相互吸引作用、靜電排斥作用和空間位阻作用.κ-酪蛋白的“發(fā)層”或稱之為“聚電解質刷”提供了空間位阻作用，即當膠粒相互碰撞時，在作用區(qū)域伸展于膠束表面的κ-酪蛋白分子將損失構型熵并提供排斥力，防止酪蛋白粒發(fā)生聚集.這種作用表明了酪蛋白表面的κ-酪蛋白向外延伸的高度(電解質刷高度H)與溶液pH之間的關系.

由圖7可知，當BC的濃度較高時，其與酪蛋白的結合更加活躍而使其乳液更穩(wěn)定.隨著pH值的增大，其沉淀率逐漸減小，由于酪蛋白本身的等電點PI為4.6，到達酪蛋白等電點使會快速沉淀酪蛋白.當pH值從3增大到5時，其沉淀率減小的較快，當pH從5增大到6時，其沉淀率變化較小，說明此時的BC酸乳最穩(wěn)定，過酸則會影響B(tài)C酸乳的穩(wěn)定性.

圖7 pH對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(2)離子強度對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

BC是一種水不溶性且電負性極弱的陰離子多糖，BC酸乳的穩(wěn)定性同時受到BC添加量及環(huán)境離子強度的共同影響.

由圖8可知，當BC濃度較低時，酸乳中的酪蛋白與BC間的非共價相互作用遠大于靜電排斥作用，起主導作用的為非共價相互作用，因此BC與酪蛋白靜電排斥作用較弱，不足以充分結合酪蛋白并對其進行穩(wěn)定，當BC濃度較高時，BC的三維網(wǎng)狀結構使酪蛋白顆粒大量結合于其網(wǎng)狀結構中，使得BC酸乳沉淀率下降，穩(wěn)定性提高.即在相同離子強度下，BC酸乳穩(wěn)定性隨著BC加量的增大而提高.

另一方面，當BC濃度較低時，隨著離子強度的增大，BC酸乳沉淀率逐漸增大，穩(wěn)定性呈現(xiàn)下降的趨勢；當BC濃度較高時，沉淀率隨離子強度的增大變化較小，表明BC可以減小離子強度對酸乳的影響.

圖8 離子強度對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(3)溫度對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

BC纖維束與蛋白質網(wǎng)絡之間通過非共價相互作用形成互穿三維網(wǎng)絡結構.由于氫鍵可能在低溫條件下更容易形成，而氫鍵的形成同樣利于體系內部與酪蛋白的結合.

由圖9可知，BC酸乳穩(wěn)定性隨環(huán)境溫度的變化呈小幅度降低的趨勢.因此當溫度從30 ℃增加到50 ℃時，其沉淀率稍有增加，當溫度從50 ℃增加到90 ℃時，其沉淀率變化不大，表明BC的網(wǎng)絡結構受較高溫度影響較小，因此溫度變化對酸乳的穩(wěn)定性影響不大.

圖9 溫度對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

2.3.2 環(huán)境應力對BC酸乳δ電位的影響

(1)pH對BC酸乳δ電位的影響

在BC酸乳體系中，一部分BC吸附于酪蛋白顆粒上形成復合物結構使得空間穩(wěn)定，另一部分會在復合物表面形成一層凝膠網(wǎng)絡來增強一部分穩(wěn)定性.

由于在穩(wěn)定乳液中存在靜電相互作用，在接近中性的條件下，靜電相互作用主要來源于酪蛋白中電離的酸根基團.當兩個具有擴散雙電層的酪蛋白膠束非常接近時，兩個雙電層的擴散部分就會開始重疊，重疊的結果會導致排斥，這種排斥作用的自由能由能夠直接測量的δ電位所取代.

由圖10可知，BC酸乳的δ-電位均為負值，當pH值從3增加到7乳液液滴的δ電位絕對值隨著pH值的增加而增加，表明可通過調節(jié)體系pH從而改變電荷大小，當有較大靜電斥力存在于液滴之中時，BC酸乳具有更好的穩(wěn)定性.

圖10 pH對BC酸乳δ電位的影響

(2)離子強度對BC酸乳δ電位的影響

BC酸乳顆粒具有相當均勻的表面，液滴的表面有性質類似于粒子本身的顆粒存在，BC可以通過皮克林機制和網(wǎng)絡機制有效的穩(wěn)定酸乳體系，皮克林機制是BC可以附著在油滴表面阻止油滴聚集，網(wǎng)絡機制指酪蛋白與BC之間形成強的網(wǎng)絡結構，由此形成的密集網(wǎng)絡可以將水和脂肪都束縛在里面而不能或者只能稍微移動，因而阻止了相的分離，從而提高了乳液的穩(wěn)定性.

由圖11可知，BC酸乳乳液液滴的δ電位絕對值隨著NaCl濃度的增加而降低，當NaCl濃度從0 mol/L增加到250 mol/L時，乳液液滴δ電位絕對值從26.2mv減小到12.5mv，即靜電斥力變小，體系穩(wěn)定性降低.因此較高離子強度環(huán)境不利于BC酸乳的穩(wěn)定.

圖11 離子強度對BC酸乳δ電位的影響

3 結論

BC酸乳制備的最優(yōu)工藝為：發(fā)酵乳含量為35%、BC的添加量為3%、復配穩(wěn)定劑CMC/黃原膠=1∶1、復配穩(wěn)定劑總量為0.5%，所制得的BC酸乳具有較好的穩(wěn)定性.酸乳中的酪蛋白可與BC網(wǎng)絡之間以非共價相互作用形成互穿三維結構，從而穩(wěn)定酪蛋白，改善酸乳脂肪上浮和蛋白質沉淀等問題，同時BC的加入可減小環(huán)境應力對BC酸乳穩(wěn)定性能的影響.

研究結果表明，BC可以作為穩(wěn)定劑用于膳食纖維酸乳制備，減小環(huán)境應力對BC酸乳的影響，且對于酸乳品質有良好的改善作用.與現(xiàn)有研究對比[20-24]，單一穩(wěn)定劑的使用或其他復配穩(wěn)定劑的使用可以在一定程度上提高酸乳穩(wěn)定性，但是成本較高且依然存在穩(wěn)定能力不足、口感不佳等問題.而本研究將BC與復配穩(wěn)定劑聯(lián)合使用，在一定程度上降低了成本，為BC作為穩(wěn)定劑產(chǎn)業(yè)化應用提供了思路.這充分表明BC在酸乳工業(yè)具有良好的應用前景.