杜 飛， 楊麗紅， 李志健， 于之涵

(陜西科技大學 輕工科學與工程學院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 輕化工程國家級實驗教學示范中心， 陜西 西安 710021)

0 引言

自紙基微流控分析技術(shù)提出以來，以濾紙為基底的紙芯片加工制造技術(shù)日益成熟.植物纖維是一種天然易于加工、改性的生物材料.可以通過物理、化學、生物等微調(diào)控方法，控制單根植物纖維細胞壁成分、疏水性、吸附性、微細纖維距離、表面活性基團等，從而達到改變成紙后紙張表面性能的目的[1-3].David M.Cate等[4]研究發(fā)現(xiàn)植物纖維種類影響抗體的固定和檢測，棉纖維原料紙芯片可以更好的檢測β-人絨毛膜促性腺激素.Cao R等[5]研究發(fā)現(xiàn)在紙基芯片表面加載葡聚糖可以對抗體起到很好的保護作用，在葡聚糖存在下抗體可以穩(wěn)定存在120天.崔輝[6]研究聚合物與纖維的吸附性能和吸附機理，發(fā)現(xiàn)在紙張的抄造過程中通過打漿變化、細小纖維添加等方法可明顯改善紙張對聚合物的吸附能力，并且不會對纖維成紙性能產(chǎn)生不利影響.

熒光標記技術(shù)[7-12]能夠檢測結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物分子，具有較高的靈敏性而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生理、環(huán)境科學等領(lǐng)域.宋春美[13]采用異硫氰酸熒光素作為標記材料標記萊克多巴胺單克隆抗體，并對其靈敏度、特異性等進行了測定.Nardo等[14]將羧基化量子點通過活化酯方法與伏馬毒素抗體偶聯(lián)作為熒光標記探針，建立了玉米中伏馬毒素 B1 熒光免疫層析試紙檢測方法.韓章潤等[15]通過熒光物質(zhì)標記糖胺聚糖觀察其與硫酸軟骨素的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)熒光標記對其生物活性沒有影響.

基體負載生物標記物的量是研究紙芯片穩(wěn)定性的前提，吸附量提高可以間接彌補由于酶活下降帶來的檢測誤差，從而增強紙芯片的穩(wěn)定性.目前公認提高紙芯片穩(wěn)定性的方法是將標記物冷凍干燥加載于紙芯片表面[16-20].將重點放在固定化材料本身表面性能和結(jié)構(gòu)對生物標記物穩(wěn)定性影響上的相關(guān)研究較少.本研究通過調(diào)整纖維配比、增加纖維表面羥基、添加木素、引入乙基和羧基基團等微調(diào)控的方法提高紙芯片基底對葡萄糖氧化酶的吸附量，間接起到增加紙芯片穩(wěn)定性的要求.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

化學漿板(針葉木漿、闊葉木漿、棉漿)：江蘇UPM 公司；熱磨機械漿，江蘇UPM公司；定性濾紙(中速，定量80 g/m2，杭州特種紙業(yè)有限公司)；葡萄糖氧化酶(10 KU，sigma)；木質(zhì)素(脫堿，上海阿拉丁生物科技有限公司)；Super Fluor 488，SE琥珀酰亞胺酯熒光試劑(南京固與生物有限公司).

1.2 實驗設(shè)備

槽式打漿機 (TD8-23，咸陽通達輕工設(shè)備有限公司)；標準漿料疏解機 (992304，瑞典 L&W)；紙樣抄取器 (TD10-200，咸陽通達輕工設(shè)備有限公司)；抗張強度試驗儀(062/969921，瑞典 L&W)；克列姆法吸水高度儀(咸陽通達輕工設(shè)備有限公司)；場發(fā)射掃描電鏡(VERIOS 460,FEI)；熒光光譜儀(FS5，英國愛丁堡)；激光共聚焦熒光顯微鏡(蔡司LCM800)；電熱鼓風干燥箱 (DHG-9053A，上海一恒科技有限公司)；電子天平 (MC249，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶溶液的配制

分別取7.9 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，0.24 g磷酸二氫鉀，1.8 g磷酸氫二鉀溶于800 mL去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.5，定容至1 L，配制為PBS緩沖液.取10 mg的葡萄糖氧化酶溶解至1 L PBS緩沖液中，保存至4 ℃?zhèn)溆?，此時酶活為1 U/mL.

1.3.2 微調(diào)控植物纖維

劉偉[21]通過打漿處理改善植物纖維表面接枝率，增加了纖維表面粗糙率，提高改性纖維對六價鉻的吸附能力.研究表明，纖維表面的粗糙度提高，生物標記物與纖維的接觸面積增大，有利于提高纖維對酶的吸附能力；朱媛媛[22]將木質(zhì)素作為吸附材料用于吸附廢水中金屬離子、染料等物質(zhì).李英[23]利用超聲波技術(shù)合成CMC吸附染料，如亞甲基藍和Pb2+、Cu2+等金屬離子，來吸附水中的污垢.

本研究采用增加纖維表面粗糙度、添加木素、引入羥基和羧基基團等微調(diào)控的方法對纖維表面進行改性.

(1)微調(diào)控法提高纖維表面粗糙度

為增加纖維的表面粗糙度，提高酶與纖維的吸附量，將闊葉木、針葉木、棉漿、樺木、HYP A(楊木)等五種植物纖維分別進行疏解打漿，打漿度分別為15 °SR、20 °SR、30 °SR、40 °SR、50 °SR，將其密封入漿袋中平衡水分，備用.

(2)微調(diào)控添加木素

木素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有較多的甲氧基、羥基和羰基,這些功能基可作為標記物的吸附位點，具有較強的化學反應(yīng)能力，越來越多的研究結(jié)果表明各種木質(zhì)素及其改性產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的吸附性能.不僅可用于吸附金屬離子等，還可用來吸附酚類、醇類、碳氫化合物、鹵化物和其他物質(zhì)如染料、殺蟲劑、蛋白質(zhì)、酶等.本研究取先前不同種類不同打漿度的植物纖維進行抄片，紙張定量為80 g/m2，將木素加熱溶解后，在紙頁成型過程中加入紙張內(nèi)，木素的質(zhì)量相對于絕干漿的1%.

(3)微調(diào)控引入羥基

Helka Juvonen等[24]、齊在前等[25]通過濾紙表面接枝、引入羥基等基團的方法增加材料對蛋白質(zhì)的吸附能力.上述研究表明，羥基等基團有助于提高生物標記物的親和能力.本研究取不同種類初始打漿度的植物纖維進行抄片，紙張定量為80 g/m2，將羥乙基纖維素溶解后，在紙頁成型過程中加入紙張內(nèi)，羥乙基纖維素的質(zhì)量相對于絕干漿的1%.

(4)微調(diào)控引入羧基

羧甲基纖維素是纖維素衍生物，存在一定數(shù)量的羧基和未被取代的羥基，易溶且保形力強，廣泛用作吸附劑、穩(wěn)定劑等.取不同種類初始打漿度的植物纖維進行抄片，紙張定量為80 g/m2，將羧甲基纖維素溶解后，在紙頁成型過程中加入紙張內(nèi)，羧甲基纖維素的質(zhì)量相對于絕干漿的1%.

1.3.3 熒光標記葡萄糖氧化酶

標記：將Super Fluor 488,SE放入干燥器中慢慢恢復(fù)至室溫后，加入無水DMSO將其溶解至濃度為1 mg/mL.將1 mg葡萄糖氧化酶加入熒光標記物溶液中，在暗處常溫攪拌1 h使其充分溶解接觸，置于-20 ℃下避光保存.

透析：將透析袋裁剪至10 cm左右，置于2%碳酸氫鈉，1 mmol/L，pH為8的混合溶液中，煮沸10 min后撈出，用去離子水將其漂洗3～4次，備用.用移液槍取50μL熒光標記后葡萄糖氧化酶，置于透析袋內(nèi)，加25 mL去離子水將其稀釋500倍，用夾子將透析袋封口，置于200 mL 0.15 mol/L氯化鈉溶液中常溫避光透析4次，每次4 h，在4 ℃下再次避光透析過夜，以除去未標記上的染料.

1.3.4 植物纖維固定化葡萄糖氧化酶

用微調(diào)控處理后的植物纖維進行抄紙，紙張定量為80 g/m2.實驗室紙頁成型器的面積為0.031 7 m2，抄片的絕干漿質(zhì)量為2.53 g.將不同微調(diào)控植物纖維所得的抄片裁剪為3 cm×3 cm的小紙片，每一抄片分別取兩個樣品，得到兩組樣品.取其中一組樣品，浸于葡萄糖氧化酶與PBS緩沖液30 s后取出，將其重新裁剪為1 cm×1 cm的小紙片，放置于4 ℃下保存，進行場發(fā)射掃描電鏡檢測.取另一組樣品將其浸于透析后的熒光標記葡萄糖氧化酶溶液中，浸泡30 s后取出，放置4 ℃下保存，進行激光共聚焦熒光顯微鏡和熒光光譜儀檢測.

1.3.5 微調(diào)控后紙基物理性能檢測

(1)抗張強度的影響

以定性濾紙為對照組，將定量為80 g/m2的紙基樣品裁剪至長為150 mm，寬為15 mm的紙條，不同植物纖維原料在不同打漿度下的紙基分別取10個樣品，備用.抗張強度S[26]通過公式(1)計算.

S=F/LW

(1)

式(1)中：S為紙張的抗張強度，N/m；F為平均抗張力，N；LW為紙張寬度，mm.

(2)紙基吸水能力的影響

以定性濾紙為對照組，將定量為80 g/m2的紙基樣品裁剪至長為200 mm，寬為15 mm的紙條，不同纖維原料在不同打漿度下所得紙基分別取3個樣品，備用.將紙條統(tǒng)一伸入克列姆吸水測定儀液下5 mm處，定時10 min后，記錄所得水印高度.

2 結(jié)果與討論

2.1 酶對纖維表面的選擇性吸附研究

圖1為不同種類纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖像.由圖1可知，葡萄糖氧化酶均分布在纖維表面，附著在單根纖維上，為微調(diào)控增強植物纖維對酶的吸附性能提供依據(jù)，進一步證明在纖維表面進行的微調(diào)控對酶吸附起決定性作用.

(a)針葉木 (b)闊葉木

(c)針+闊,質(zhì)量比為1∶1 (d)熱磨機械漿

(e)熱磨機械漿 (f)對照組濾紙圖1 不同種類纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖像(×3 500)

2.1.1 紙基表面葡萄糖氧化酶吸附量與熒光強度的關(guān)系

為驗證植物纖維吸附葡萄糖氧化酶的量與熒光強度之間的關(guān)系，利用熒光光譜儀對其結(jié)果進行表征，取實驗1.3.3中所配置1 mg/mL熒光標記后葡萄糖氧化酶進行實驗.將標記后酶溶液分別進行不同倍數(shù)稀釋，將其稀釋至50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍后，取50μL加載于3 cm×3 cm面積的小紙片上，小紙片以闊葉木漿為例，以定性濾紙作為對照組，每個樣品測量10次，取其平均值后，所得結(jié)果如圖2所示.

(a)闊葉木熒光強度

(b)定性濾紙熒光強度

(c)熒光強度與熒光標記酶稀釋倍數(shù)的關(guān)系圖2 紙基表面葡萄糖氧化酶吸附量與熒光強度的關(guān)系

由圖2可知，闊葉木與定性濾紙的熒光強度均與熒光標記酶的濃度有關(guān)，且大致呈比例關(guān)系，隨著熒光標記酶溶液的稀釋倍數(shù)增大，植物纖維吸附酶后的熒光強度減小.即熒光標記酶的濃度越大，紙基材料吸附酶后的熒光強度越大，即熒光強度可作為判斷植物纖維對葡萄糖氧化酶吸附性能研究的重要依據(jù).

2.1.2 微調(diào)控對不同纖維吸附酶的影響

以定性濾紙為例，微調(diào)控后的不同種類纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM結(jié)果如圖3～7所示.由圖可知，葡萄糖氧化酶均負載于纖維表面.圖3～7中的(c)圖表示纖維從原始打漿度15 °SR提高到50 °SR時，纖維表面的粗糙度增加，并增大了酶與纖維的吸附面積，因此纖維對酶的吸附量明顯增加.圖3～7中的(d)、(e)、(f)圖分別表示在原始纖維基礎(chǔ)上添加木素、引入羧基、羥基基團后，纖維對酶的吸附量明顯多于圖3～7中(b)圖所示原始纖維對酶的吸附量.

(a)定性濾紙 (b)15 °SR闊葉木 (c)50 °SR闊葉木

(d)闊+木素 (e)闊+CMC (f)闊+HEC圖3 微調(diào)控后闊葉木纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖

(a)定性濾紙 (b)15 °SR針葉木 (c)50 °SR針葉木

(d)針+木素 (e)針+CMC (f)針+HEC圖4 微調(diào)控后針葉木纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖

(a)定性濾紙 (b)15 °SR混合纖維 (c)50 °SR混合纖維

(d)混合+木素 (e)混合+CMC (f)混合+HEC圖5 微調(diào)控后混合纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖

(d)棉+木素 (e)棉+CMC (f)棉+HEC圖6 微調(diào)控后棉纖維吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖

(a)定性濾紙 (b)TMP 15 °SR (c)TMP 50 °SR

(d)TMP+木素 (e)TMP+CMC (f)TMP+HEC圖7 微調(diào)控后TMP吸附葡萄糖氧化酶的SEM圖

為進一步驗證SEM結(jié)果，用1.3.3所述方式，使用熒光標記物Super Fluor 488，SE對葡萄糖氧化酶進行標記，并采用激光共聚焦熒光顯微鏡進行表征，所得結(jié)果如圖8～12所示.

激光共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果顯示，圖8～12展示了×63油鏡下，定性濾紙與微調(diào)控前后不同纖維種類對葡萄糖氧化酶的吸附情況，結(jié)果顯示微調(diào)控后纖維熒光亮度較強；相比較而言，定性濾紙以及未進行微調(diào)控的闊葉木纖維吸附葡萄糖氧化酶數(shù)量較少，熒光亮度較弱.進一步驗證了SEM表征結(jié)果.

(a)定性濾紙 (b)15 °SR闊葉木 (c)50 °SR闊葉木

(d)闊+木素 (e)闊+CMC (f)闊+HEC圖8 闊葉木纖維吸附熒光標記酶的激光共聚焦熒光顯微鏡圖像

(d)針+木素 (e)針+CMC (f)針+HEC圖9 針葉木纖維吸附熒光標記酶的激光共聚焦熒光顯微鏡圖像

(a)定性濾紙 (b)15 °SR混合 (c)50 °SR混合纖維

(d)Mix+木素 (e)Mix+CMC (f)Mix+HEC圖10 混合纖維吸附熒光標記酶的激光共聚焦熒光顯微鏡圖像

(a)定性濾紙 (b)15 °SR棉纖維 (c)50 °SR棉纖維

(d)棉+木素 (e)棉+CMC (f)棉+HEC圖11 棉纖維吸附熒光標記酶的激光共聚焦熒光顯微鏡圖像

(a)定性濾紙 (b)TMP15 °SR (c)TMP 50°SR

(d)TMP+木素 (e)TMP+CMC (f)TMP+HEC圖12 TMP吸附熒光標記酶的激光共聚焦熒光顯微鏡圖像

用1.3.3所述方式制樣，使用熒光標記物Super Fluor 488，SE對葡萄糖氧化酶進行標記，采用熒光光譜儀對微調(diào)控后載酶纖維進行表征，所得結(jié)果如圖13～17所示.

圖13～17熒光光譜儀結(jié)果顯示，微調(diào)控后不同纖維固定葡萄糖氧化酶的熒光強度均高于未進行微調(diào)控纖維與定性濾紙.即經(jīng)微調(diào)控方法處理后的多種植物纖維對酶的吸收量均增加，且增加量為95%～220%，微調(diào)控手段有效且具有廣譜性.

圖13 熒光標記酶在闊葉木纖維上的熒光強度

圖14 熒光標記酶在針葉木纖維上的熒光強度

圖15 熒光標記酶在混合纖維上的熒光強度

圖16 熒光標記酶在棉纖維上的熒光強度

圖17 熒光標記酶在TMP上的熒光強度

2.2 微調(diào)控對植物纖維的物理性能影響

2.2.1 微調(diào)控對纖維抗張強度的影響

植物纖維由于其纖維自身的差異具有不同的抗張強度，通過微調(diào)控后經(jīng)相同抄片條件下所得的紙基以1.3.5(1)所述方式制樣后，抗張強度結(jié)果如圖18所示，所得結(jié)果為10個樣品測試后的平均值.

圖18結(jié)果顯示，隨著打漿度的提高，植物纖維紙基的抗張強度迅速增強，在相同抄片條件下，在纖維內(nèi)添加木素、引入羥基羧基基團等微調(diào)控手段對植物纖維的抗張強度沒有負面影響，且微調(diào)控后紙芯片紙基的抗張強度增加量為4.9%～39%，其中提高打漿度時抗張強度增加量為520%～740%.

圖18 微調(diào)控前后各纖維的抗張強度

2.2.2 微調(diào)控對纖維毛細吸收性能的影響

以1.3.5(2)所述方式制樣，利用克列姆法對紙基的吸水性能檢測，以濾紙為對照組，以微調(diào)控處理后闊葉木紙基、TMP紙基為例進行纖維毛細吸水能力測試，結(jié)果如圖19所示，所得結(jié)果為每組樣品測量3次的平均值.

圖19、圖20結(jié)果顯示，以定性濾紙為對照組，微調(diào)控后紙基纖維的毛細吸水性能隨著打漿度的增加呈稍下降趨勢，纖維的毛細吸水高度隨打漿度升高而降低；通過加入木素，或引入羥基羧基等親水性基團時，纖維的毛細吸水性能略微增強，微調(diào)控后毛細吸水高度增加量為0.1%～13.9%.

(a)闊葉木紙基 (b)TMP紙基圖19 微調(diào)控前后各纖維的毛細吸水能力(圖片中從左至右依次為濾紙、原始纖維、50 °SR纖維、原始纖維+木素、原始纖維+HEC、原始纖維+CMC)

圖20 微調(diào)控前后各纖維的毛細吸水高度

3 結(jié)論

本研究通過對植物纖維進行打漿提高表面活性羥基，配比，添加木素，添加CMC、HEC引入羧基、羥基等基團的微調(diào)控手段，提高植物纖維對葡萄糖氧化酶的吸附量，提高紙芯片的穩(wěn)定性，以定性濾紙作為對照組，重點探究了微調(diào)控前后植物纖維對葡萄糖氧化酶的吸附量以及微調(diào)控對紙芯片核心物理性能的影響.

(1)SEM與激光共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果均顯示，以濾紙為對照組時，微調(diào)控后的不同漿種對酶的吸附量均增加，通過提高纖維表面粗糙度，增加酶與纖維的吸附面積，引入羥基、羧基等基團均可增強不同種類植物纖維對葡萄糖氧化酶的吸附，即微調(diào)控手段對增強紙芯片穩(wěn)定性有效且具有廣譜性.

(2)紙芯片的核心物理性能包括抗張強度和毛細吸水能力，對微調(diào)控后紙芯片紙基核心物理性能進行測定，結(jié)果表明微調(diào)控后紙芯片紙基的抗張強度增加量為4.9%～39%，其中提高打漿度時抗張強度增加量為520%～740%，微調(diào)控后紙芯片紙基的毛細吸水高度增加量為0.1%～13.9%.即微調(diào)控方法可有效提高紙芯片紙基對酶的吸附性能，且未改變紙芯片的親水性質(zhì)或紙芯片的強度性能造成明顯影響.