張玉潔， 朱 蘋， 孫怡琳， 郟雁飛， 馬曉麗*

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系, 山東 濰坊 261053； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院, 陜西 楊凌 712100； 3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心, 山東 濟(jì)南 250013)

0 引言

吸煙是誘發(fā)肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)境因素之一，煙草中主要成癮成分尼古丁通過(guò)激活細(xì)胞表面尼古丁乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)影響細(xì)胞增殖、粘附和遷移等功能[1-3].nAChR是配體門控通道超家族成員之一，由兩種亞單位(α1-10，β1-4)構(gòu)成的同源或異源性五聚體[4-6]，全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)研究結(jié)果表明，位于人15號(hào)染色體上編碼α3、α5和β4亞基的CHRNA3/A5/B4基因簇為尼古丁依賴相關(guān)的基因，異源性五聚體α5-nAChR的編碼基因膽堿能受體煙堿α5亞基(cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit,CHRNA5)與吸煙相關(guān)性肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[7, 8]，它的功能多態(tài)性與尼古丁依賴和肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可能是人群中吸煙相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的遺傳標(biāo)記[9-11].其中編碼α5-nAChR的CHRNA5基因突變和肺癌發(fā)生尤為相關(guān)[12, 13]，但α5-nAChR蛋白在肺鱗癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性尚未見報(bào)道.

本研究通過(guò)Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在肺鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，再利用免疫組化方法檢測(cè)α5-nAChR在臨床肺鱗癌患者組織樣本和癌旁組織中的表達(dá)情況，分析其與吸煙史之間的相關(guān)性，以探究CHRNA5在吸煙相關(guān)性肺鱗癌的表達(dá)及臨床診斷意義.

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌腫瘤組織芯片購(gòu)自上海芯超生物技術(shù)有限公司，芯片型號(hào)為No.OD-CT-RsLug04-004，包含來(lái)自于52例腫瘤病人的肺鱗癌組織及癌旁組織，患者年齡39～78歲，平均年齡62歲，其中男性30例，女性22例，具有吸煙史22例，沒有吸煙史30例，51例病理分級(jí)為Ⅰ-Ⅱ級(jí)，1例為Ⅱ-Ⅲ級(jí)，本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)參數(shù)根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)所判定.α5-nAchR兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基因芯片的數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，根據(jù)需要設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件.本研究設(shè)置的數(shù)據(jù)提取條件為：①“Gene: CHRNA5”；②“Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis”；③“Cancer Type: Lung cancer”；④“Data Type: mRNA”；⑤臨界值設(shè)定條件(Pvalue<0.05， fold change>2，gene rank=Top 10%) .P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.2.2 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)

通過(guò)TCGA(http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用R2.15.3 軟件Epicalc 函數(shù)包下載并預(yù)處理肺鱗癌數(shù)據(jù)集TCGA-LUSC-HiSeqV2數(shù)據(jù)的mRNA表達(dá)，保留TCGA數(shù)據(jù)集中包含臨床參數(shù)的病例，并根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)樣本的CHRNA5表達(dá)進(jìn)行排序，取其中位數(shù)上下定義為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過(guò)結(jié)合年齡、性別、病例分期、吸煙史等臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析.

1.2.3 免疫組織化學(xué)

用二甲苯脫去包埋在組織芯片上的石蠟，梯度乙醇脫水，然后用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，在室溫下用0.3%的雙氧水孵育15分鐘以去除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶活性，組織芯片再用山羊血清孵育30分鐘進(jìn)行封閉，隨后用α5-nAchR一抗(稀釋度1∶500)對(duì)組織芯片進(jìn)行4 ℃ 孵育過(guò)夜，用生物素二抗室溫進(jìn)行孵育15分鐘，然后用辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15分鐘，隨后用DAB進(jìn)行染色，再利用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片.

1.2.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量積分法，對(duì)每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，根據(jù)兩項(xiàng)得分的乘積確定其陽(yáng)性強(qiáng)度.染色強(qiáng)度：陰性(無(wú)著色)0分，弱陽(yáng)性(淡黃色細(xì)顆粒)1分，中等陽(yáng)性(棕黃色顆粒)2分，強(qiáng)陽(yáng)性(褐黃色顆粒)3分；染色面積：0～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%以上為3分.采用積分綜合計(jì)量：免疫組化評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色范圍評(píng)分.隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200)，按以上評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，取平均值為最后得分，<4者為陰性，>4者為陽(yáng)性.所有切片均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估算分.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件完成，定量數(shù)據(jù)應(yīng)用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；定性數(shù)據(jù)采用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 CHRNA5 在臨床常見腫瘤中的表達(dá)

截止到2019年8月，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄402個(gè)關(guān)于CHRNA5 基因表達(dá)水平的相關(guān)研究，其中癌組織和正常組織間存在顯著差異表達(dá)的有27個(gè)數(shù)據(jù)集，13個(gè)數(shù)據(jù)集顯示CHRNA5在癌組織中高表達(dá)，14個(gè)數(shù)據(jù)集在癌組織中低表達(dá)(如圖1所示).

圖1 基于Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在臨床常見腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 CHRNA5在肺腫瘤和肺鱗癌中的表達(dá)

通過(guò)對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)mRNA芯片數(shù)據(jù)集對(duì)比分析了肺癌組織與正常組織中CHRNA5基因的差異表達(dá)(如圖2所示)，其中有4個(gè)芯片數(shù)據(jù)(包括514個(gè)樣本)提示了肺癌組織中CHRNA5表達(dá)水平顯著升高.分別是Beer Lung、Hou Lung、Selamat Lung和Stearman Lung.

其中，有兩個(gè)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)為CHRNA5在肺鱗癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況(如圖3所示)，CHRNA5在肺鱗癌中的表達(dá)量均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[9].分別是Hou Lung和TCGA Lung2.

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在肺鱗癌中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

通過(guò)對(duì)491例TCGA數(shù)據(jù)集中肺鱗癌RNA-SEQ數(shù)據(jù)結(jié)合相關(guān)病理學(xué)特征進(jìn)行分析，其中男364例，女127例，年齡39～90歲，中位年齡為67歲，結(jié)果顯示，CHRNA5表達(dá)上調(diào)和TNM分期(P>0.05)無(wú)關(guān)，與年齡(P=0.048)、性別(P=0.01)、吸煙史(P=0.01)以及吸煙量(P=0.037)相關(guān)性顯著(如表1所示).

圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在肺癌組織中與正常肺組織中的表達(dá)

(a)CHRNA5在Hou Lung數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)

(b)CHRNA5在TCGA Lung2數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)圖3 Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在肺鱗癌中的表達(dá)

表1 CHRNA5與肺鱗癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

注：N表示肺癌患者的樣本數(shù)

2.4 α5-nAchR在臨床肺鱗癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，α5-nAchR主要表達(dá)于細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)大小不一的棕黃色顆粒，且在肺鱗癌組織及癌旁組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量有差異(圖4(a)、(b)).在癌旁組織中α5-nAchR的染色較弱，而肺鱗癌組織中α5-nAchR染色較強(qiáng).

(a)癌旁組織 (b)肺鱗癌組織

(c)有吸煙史的肺鱗癌組織 (d)無(wú)吸煙史的肺鱗癌樣本圖4 α5-nAchR在肺鱗癌中的表達(dá)(200×)

52例肺鱗癌組織中，27例(27/52，51.9%)癌組織存在不同程度的α5-nAchR的表達(dá)水平升高，而在癌旁組織中，α5-nAchR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為28.8%(15/52)(如表2所示)，提示在肺鱗癌組織中，α5-nAchR蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織(P=0.027).

表2 α5-nAchR在肺鱗癌和癌旁組織中的表達(dá)

結(jié)合吸煙史分析發(fā)現(xiàn)，在有吸煙史的肺鱗癌組織標(biāo)本中，肺鱗癌患者組織標(biāo)本α5-nAchR在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色較深，而在無(wú)吸煙史患者的組織標(biāo)本中，α5-nAchR在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色較淺(圖4(c) 、 (d))，且在23例有吸煙史標(biāo)本中，18例(18/23，69.6%)患者α5-nAchR高表達(dá)(如表3所示)，結(jié)果顯示α5-nAchR在有吸煙史的肺鱗癌患者組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非吸煙患者肺鱗癌組織(P=0.029).

表3 α5-nAchR表達(dá)與肺鱗癌患者吸煙史的關(guān)系

3 結(jié)論

吸煙是誘發(fā)肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)境因素，煙草中最重要的成癮成分，尼古丁可以通過(guò)結(jié)合并激活尼古丁乙酰膽堿受體(nAChR)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移[14-16].已有研究證明，α5-nAChR對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖、HIF-1α以及VEGF等蛋白的表達(dá)有影響[17, 18]，且α5-nAChR蛋白高表達(dá)和肺腺癌患者吸煙史、生存率存在相關(guān)性[19-21]，尼古丁還能通過(guò)α5-nAChR的表達(dá)激活JAK/STAT3、Jab1/STAT3進(jìn)一步參與調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22-24]，以上研究對(duì)象皆為肺腺癌，α5-nAChR在肺鱗癌中表達(dá)情況以及和臨床病理特征之間關(guān)系仍未見報(bào)道.

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)涵蓋多種腫瘤樣本的數(shù)據(jù)庫(kù)，包含基因差異表達(dá)分析、臨床相關(guān)性分析等多種功能.本研究先通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHRNA5在肺鱗癌中的差異表達(dá)，并結(jié)合免疫組織化學(xué)方法分析了α5-nAChR蛋白在肺鱗癌芯片樣本中的表達(dá)，證明CHRNA5在肺鱗癌中表達(dá)及臨床意義，提示CHRNA5作為生物標(biāo)記物具有識(shí)別吸煙者疾病風(fēng)險(xiǎn)升高的潛力.CHRNA5可能為吸煙相關(guān)性肺癌發(fā)生、發(fā)展的客觀參考指標(biāo)，為肺癌的研究和治療提供了新的思路.本研究今后擬進(jìn)一步擴(kuò)大樣本例數(shù)，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪，探討CHRNA5與肺鱗癌患者預(yù)后生存期關(guān)系及臨床意義，為CHRNA5成為肺癌治療的靶點(diǎn)之一提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).