趙串串， 溫懷峰

(陜西科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

2019年1月1日，伴隨著《土壤污染防治法》的生效，土壤污染防治也將進入“新紀元”.研究發(fā)現(xiàn)木本植物具有生物量大、根系發(fā)達、對重金屬耐性好、經(jīng)濟可行，抑制污染向食物鏈中轉移等優(yōu)勢，將其應用于重金屬污染土壤的修復具有良好的前景[1].重金屬脅迫對植物的危害是在各種環(huán)境因素(也包括植物本身)的綜合作用下進行的，即使是同一種金屬元素，同一濃度，在不同的環(huán)境條件下，對植物的危害也會表現(xiàn)出明顯的差異[2-4].鎘(Cd)脅迫對木本植物光合作用的影響可能存在較為復雜的調控機制[5].馮建燦等[6]研究認為葉綠素熒光動力學參數(shù)是評價植物逆境生理的有效方法.

研究表明，樺樹對逆境脅迫具有較好的適應性和較強的調控能力[7]，目前研究主要集中在鹽脅迫[8]，干旱/澇漬脅迫[9,10]及高/低溫脅迫[11,12]等方面.重金屬脅迫對白樺(BetulaPlatyphyllaSuk.)生理指標影響有待進一步揭示.本文以2 年生白樺幼苗為試材，通過盆栽試驗，基于葉綠素熒光技術，研究Cd脅迫對白樺幼苗光合熒光特性及葉綠素含量的影響，探究白樺對高濃度Cd脅迫的適應性及耐受性.

1 實驗部分

1.1 研究對象

1.1.1 幼苗

本研究以2年生木本植物白樺幼苗為對象，白樺幼苗取自青海省林業(yè)廳造林育苗苗圃.

1.1.2 土壤基質

以土壤、蛭石、蚯蚓糞(V∶V∶V=3∶1∶1)混合物為盆栽基質.將CdCl2·2.5H2O(AR)與去離子水配成母液，然后稀釋成所需的處理濃度，施入相應的盆栽土壤中.將白樺幼苗栽種于直徑15 cm、高25 cm的塑料盆中，土壤質量約5 kg，盆底放置兩層塑料紙.根據(jù)課題組前期實驗及文獻資料，張春燕等[13]報道了廢水灌溉土壤中Cd含量為 10.69～173.64 mg/kg.韋月越[14]研究報道了某礦山土壤Cd含量最高達448.50 mg/kg.楊園等[15]研究結果表明土壤中Cd濃度在150 mg/kg使楊樹葉綠體內(nèi)部的基粒結構發(fā)生改變，從而對光合作用產(chǎn)生抑制.本文土壤Cd濃度設定為0，50 mg/kg，100 mg/kg，200 mg/kg 4組，依次記為control，50 Cd，100 Cd，200 Cd，每組設3個重復.

1.2 實驗儀器

LI-6400XT (LI-COR Inc.,Lincoln,Nebraska,USA) 便攜式光合系統(tǒng)；752紫外-可見光分光光度計 (上海舜宇恒平儀器有限公司).

1.3 測定方法

1.3.1 白樺光合熒光參數(shù)測定

采用LI-6400XT測定白樺葉片光合作用氣體交換參數(shù)，光合光響應曲線和葉綠素熒光參數(shù).脅迫前于2017年6月9日測定，實驗啟動后分別于脅迫3周(wks)、5 wks后于09∶00～11∶30間分別進行測定.實驗結束后測定白樺葉綠素含量.

光合熒光參數(shù)及葉片光合作用對光合有效輻射(PAR)響應曲線測定，采用LI-6400XT.測定參數(shù)：最小熒光產(chǎn)量(F0)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)、PSⅡ原初反應的最大量子效率(Fv/Fm)[16]及潛在活性(Fv/F0)、有效光量子化學效率(Fv′/Fm′)，PSⅡ反應中心實際光量子化學效率(ΦPSⅡ)，表觀電子傳遞速率(ETR)，及非光化學淬滅(NPQ)，凈光合速率(Pn)，氣孔導度(Gs)，胞間CO2濃度(Ci)，蒸騰速率(Tr)，計算氣孔限制值(Ls)[17].其中，Ls的計算公式為：Ls=1-Ci/Ca式中Ca為大氣CO2濃度.PAR梯度設定為2 000μmol/(m2·s)、1 800μmol/(m2·s)、1 500μmol/(m2·s)、1 200μmol/(m2·s)、900μmol/(m2·s)、700μmol/(m2·s)、500μmol/(m2·s)、400μmol/(m2·s)、300μmol/(m2·s)、200μmol/(m2·s)、100μmol/(m2·s)、75μmol/(m2·s)、50μmol/(m2·s)、25μmol/(m2·s)和0μmol/(m2·s).使用直角雙曲線修正模型對測得的光響應曲線進行擬合[18].試驗期間，環(huán)境溫度為28.34±2.03 ℃，大氣CO2濃度為392.04±16.35μmol/(m2·s).

1.3.2 葉綠素含量測定

參考胡秉芬等[19]的方法，采用95%乙醇溶液為提取劑，研磨、浸提后，取上清液其在波長為663 nm、645 nm處的吸光度.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差，經(jīng)方差分析后進行多重比較(Tukey′s 法，α=0.05).在SPSS 20.0中進行雙因素方差分析(Two-wayANOVA)來揭示Cd處理與脅迫周數(shù)及交互作用對白樺苗木各光合與葉綠素熒光指標的影響，Cd濃度和暴露于Cd脅迫的周數(shù)作為每周測量數(shù)據(jù)的自變量.用Origin 8.6繪圖軟件作圖.

2 結果與討論

2.1 Cd脅迫對白樺葉片葉綠素含量的影響

Cd脅迫下白樺葉片的葉綠素含量如圖1所示.由圖1可知，Cd脅迫顯著降低了葉綠素含量(P<0.05).其中，葉綠素a含量的變化最為顯著，總葉綠素含量與葉綠素a/b的降低主要由于葉綠素a含量的減少造成.

圖1 Cd脅迫對白樺葉綠素含量的影響

脅迫5 wks后，w(Cd)為50 mg/kg 時，與control相比，白樺葉片的葉綠素a含量增加了7.67%；w(Cd)為100和200 mg/kg時，白樺葉片的葉綠素a含量分別減小了22.51%和35.55%，同時總葉綠素含量和葉綠素a/b也分別降低了21.28%、32.77%和5.40%、13.67%.表明Cd脅迫會影響葉綠素的含量，主要通過在類囊體膜上大量累積，從而破壞了葉綠體結構以及葉綠素合成酶的活性[20]，從而導致葉綠素含量的降低.當w(Cd)為50 mg/kg 時，與脅迫前相比，脅迫3～5 wks后，白樺的Pn下降后上升；同時，Gs、Ci也顯著增大，更多CO2通過氣孔進入葉肉細胞，葉綠素的含量上升，說明白樺葉綠素合成的阻礙得到緩解，刺激白樺光合作用增強，使Pn上升[21].

2.2 Cd脅迫對白樺苗木光合特性的影響

Cd脅迫下白樺苗木氣體交換參數(shù)測定如表1所示.由表1可知，與脅迫前相比，Cd脅迫顯著降低了白樺的Pn、Gs、Tr及Ls；同時，不同濃度的Cd處理基本使白樺的Pn、Gs、Tr及Ls表現(xiàn)出先減后增的趨勢.當w(Cd)為50 mg/kg時，脅迫5 wks后，與脅迫3 wks后相比，白樺的Pn上升到脅迫前的97.70%，且與脅迫前無顯著差異；與脅迫5 wks 后的control相比，白樺的Pn增加了11.84%.

表1 Cd脅迫對白樺苗木氣體交換參數(shù)的影響

注:A、B、C表示同一Cd處理下不同脅迫時間對白樺的影響在0.05水平上顯著差異；a、b、c表示相同脅迫時間下不同Cd處理對白樺的影響在0.05水平上顯著差異.**表示P<0.01.F時間,時間效應；FCd,Cd效應；F時間×cd,時間與Cd的交互效應.

雙因素方差分析表明，脅迫時間與Cd作為獨立因子時均顯著影響了白樺葉片的Pn、Gs、Ci和Tr，當w(Cd)為100 mg/kg 時，交互條件下脅迫時間顯著促進了Pn、Gs、Tr及Ls的回升，降低了Ci值；而當w(Cd)為200 mg/kg 時，脅迫顯著抑制了白樺的光合作用，使葉片的Pn、Ci及Tr持續(xù)降低.

Cd脅迫下白樺葉片的Pn、Gs和Ls均呈顯著下降(P<0.05)的趨勢，Ci上升，表明白樺的光合作用主要受非氣孔因素的限制，與前人的研究結論一致[17,22].w(Cd)為100 mg/kg時，脅迫全周期內(nèi)，白樺的Pn下降后出現(xiàn)回升的趨勢，表明該脅迫下白樺通過反饋機制調節(jié)產(chǎn)生了適應性，從而減弱了Cd對白樺光合作用的抑制[23].隨著脅迫周期的延長，葉綠素含量以及葉綠素a/b顯著減少，說明Cd脅迫對白樺葉綠素a的影響比葉綠素b大；Ci值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，可能由于初期Cd脅迫破壞了葉綠體的結構或使葉綠體酶活性發(fā)生變化，進而影響葉綠體的合成及光合作用，導致Ci增大[24]；而Gs和Ci呈相反的趨勢，脅迫5 wks 后，Gs增大，Ci反而減小，白樺對Cd脅迫產(chǎn)生了適應性.

2.3 Cd脅迫對白樺苗木光合-光響應特性的影響

各組白樺葉片Pn的光響應曲線見圖2.由圖2可知，隨著光強的增大，白樺的Pn在PAR<200μmol/(m2·s) 時迅速上升；當PAR達到700μmol/(m2·s)時，白樺的Pn逐漸平穩(wěn)，達到飽和.不同濃度的Cd處理顯著降低了白樺的光合作用強度，并使白樺葉片更容易達到光飽和狀態(tài)；相同濃度Cd處理下，脅迫時間也顯著抑制了白樺的Pn對光強的響應.

(a)control

(b)50 mg/kg

(c)100 mg/kg

(d)200 mg/kg圖2 Cd脅迫對白樺葉片光響應曲線的影響

由圖2(b)可知，w(Cd)為50 mg/kg 時，脅迫5 wks后，白樺的Pn對光強的響應與脅迫前無顯著差異.由圖2(c)可知，w(Cd)為100 mg/kg 時，與脅迫3 wks后相比，脅迫5 wks后，白樺的Pn隨著光強的增大，有小幅度上升.由圖2(d)可知，w(Cd)為200 mg/kg 時，脅迫5 wks后，白樺的Pn對光強的響應持續(xù)減弱,表明高濃度Cd脅迫降低白樺對光的利用能力，分析原因是高濃度Cd脅迫降低了葉綠素的含量，尤其是葉綠素a的含量.

2.4 Cd脅迫對白樺苗木熒光特性的影響

Cd脅迫下白樺苗木葉綠素熒光參數(shù)見表2.由表2可知，與脅迫前相比，Cd脅迫顯著降低了白樺的Fm、Fv/Fm及Fv/F0；隨著脅迫時間的延長，不同濃度的Cd處理使白樺的Fm、Fv/Fm和Fv/F0持續(xù)減小.w(Cd)為50 mg/kg時，脅迫3 wks后，白樺葉片的F0達到最大值為535.28；脅迫5 wks后，F(xiàn)0與脅迫前無顯著差異，F(xiàn)m、Fv/Fm及Fv/F0達到脅迫前的95.33%、98.73%和93.72%.其中Fv/Fm及Fv/F0與control相比增加了1.27%和4.13%.

雙因素方差分析表明，脅迫時間與Cd作為獨立因子時均顯著影響了白樺葉片的F0、Fm、Fv/Fm和Fv/F0.w(Cd)為100 mg/kg時，交互條件下脅迫時間顯著促使了F0的上升，降低了Fm、Fv/Fm和Fv/F0值.w(Cd)為200 mg/kg 時，脅迫時間使葉片的F0、Fm、Fv/Fm和Fv/F0顯著降低.

Cd脅迫對白樺光下熒光參數(shù)的影響見圖3.由圖3可知，脅迫全周期內(nèi)，Cd脅迫顯著降低了白樺的Fv′/Fm′、ΦPSⅡ及ETR，且不同濃度的Cd處理基本使白樺的Fv′/Fm′、ΦPSⅡ和ETR持續(xù)減??；同時白樺的NPQ值(除50Cd外)顯著增加.非光化學淬滅(NPQ)反映PSⅡ反應中心的關閉程度[25,26]，是植物免受光損失的重要自我保護機制[27].Andresen等[28]的研究表明，當脅迫強度超出一定閾值，這種保護機制的作用就會受到局限.如圖3(d)所示，當w(Cd)為50 mg/kg時，脅迫5 wks后，與脅迫3 wks后相比，白樺葉片的NPQ顯著降低 (降至最小值為0.74)，占脅迫前該處理的94.27%；而Fv′/Fm′、ΦPSⅡ及ETR均顯著升高，分別占脅迫前的112.12%、103.49%和105.94%.w(Cd)為100 mg/kg時，脅迫顯著促進了NPQ的上升，說明白樺過剩光能主要以熱耗散的形式散失，保護自身光合器官的生理活性[29]；w(Cd)為200 mg/kg時，脅迫使葉片的Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、NPQ及ETR值顯著降低，說明白樺已喪失部分熱耗散能力，NPQ保護機制作用受限.

注:A、B、C表示同一Cd處理下不同脅迫時間對白樺的影響在0.05水平上顯著差異；a、b、c表示相同脅迫時間下不同Cd處理對白樺的影響在0.05水平上顯著差異.*、**分別表示0.01

(c)表觀電子傳遞速率(ETR)

(d)非光化學淬滅(NPQ)圖3 Cd脅迫對白樺光下熒光參數(shù)的影響

PSⅡ原初反應的最大量子效率Fv/Fm、有效光量子化學效率Fv′/Fm′和PSⅡ實際光化學量子效率ΦPSⅡ是判斷植物是否受到光抑制的重要指標.Fv′/Fm′反映開放的PSⅡ反應中心的有效原初光能捕獲效率[30].ΦPSⅡ反映PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率，即實際光能捕獲能力.Guo等[31]和Semida等[32]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v/Fm反映的是最大PSⅡ光能轉化效率，如果Fv/Fm小于0.80，說明葉片的PSⅡ反應中心潛在光合能力和潛在活性受損.Cd脅迫會導致ETR顯著降低(P<0.05)[33]，阻礙電子傳遞，進而抑制光合作用.

本研究中，脅迫周期內(nèi)，w(Cd)為50 mg/kg 時，F(xiàn)v/Fm、Fv′/Fm′和ΦPSⅡ無顯著差異，分別為0.80、0.71和0.67，而ETR則顯著升高(P<0.05)；與control相比，F(xiàn)v/Fm、Fv′/Fm′和ΦPSⅡ均有所提升，表明50 mg·kg-1的Cd處理促進了白樺葉片的光捕獲能力及光合作用過程中的電子傳遞速率，從而促進了白樺光合作用.w(Cd)為200 mg/kg 時，F(xiàn)v/Fm仍能保持較高水平為0.73，說明Cd脅迫對白樺潛在光合能力以及PSⅡ反應中心活性的影響較小.而Fv′/Fm′和ΦPSⅡ顯著減小，分別為0.43和0.30，說明Cd脅迫對白樺實際光合能力的影響是存在的，可能由于高濃度Cd脅迫降低了葉綠素含量，直接抑制光合作用.

3 結論

(1)w(Cd)為200 mg/kg時，脅迫使白樺葉片的葉綠素含量顯著減少(P<0.05)，電子傳遞受阻，光捕獲能力減弱，光能利用能力減弱，白樺熱耗散能力被破壞，從而抑制其光合作用.

(2)w(Cd)為50 mg/kg時，持續(xù)5 wks后，白樺的Pn與control相比增長了11.84%，而w(Cd)為100和200 mg/kg時，Pn顯著降低，表明白樺對低濃度Cd暴露表現(xiàn)出興奮效應.

(3)w(Cd)低于100 mg/kg時，白樺葉片的ΦPSII、NPQ和ETR等參數(shù)基本維持在一定的范圍，說明白樺可以依靠自身抗逆性緩解Cd對反應中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到恢復進而緩解Cd脅迫對白樺的光合損害，表明白樺對Cd脅迫具有一定的耐受性.