陳文亮，蘇米亞，賈宏信，齊曉彥

（光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436）

β-酪蛋白廣泛存在于哺乳動(dòng)物（牛、山羊、牦牛、馬、兔等）和人的乳汁（母乳）中，在牛乳中占總蛋白質(zhì)的24%～28%（約占總酪蛋白的45%），在母乳中占總蛋白質(zhì)的15%～30%（占總酪蛋白的50%～85%），100 mL成熟母乳中大約含有0.4 mgβ-酪蛋白[1-2]，因此β-酪蛋白是母乳的主要蛋白質(zhì)成分。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，母乳中含有多種來源于β-酪蛋白的天然乳源生物活性肽，對(duì)新生兒具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和飽腹等多種不同生理功能。由于母乳與牛乳中的β-酪蛋白構(gòu)成存在差異，并且β-酪蛋白具有多種亞型，各亞型具有不同的生理功能，因此牛乳β-酪蛋白并不能簡(jiǎn)單替代母乳β-酪蛋白。母乳是嬰兒配方乳粉的黃金標(biāo)準(zhǔn)，在模擬母乳β-酪蛋白構(gòu)成的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在活性肽水平上模擬母乳組成，使嬰幼兒配方乳粉中的生物活性肽水平接近母乳，能夠進(jìn)一步滿足嬰兒對(duì)蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)的需求。本文論述β-酪蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、性質(zhì)、各功能特性及其在嬰幼兒配方乳粉中的應(yīng)用研究進(jìn)展，為嬰兒配方乳粉產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1β-酪蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

1.1 β-酪蛋白的氨基酸組成

β-酪蛋白分子由一定數(shù)量的氨基酸殘基組成。在分子水平上，牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白存在明顯差異。牛乳β-酪蛋白是完全磷酸化的分子，含有209 個(gè)氨基酸殘基，磷酸化前的一級(jí)結(jié)構(gòu)分子質(zhì)量為23.6 kDa，而5 個(gè)Ser殘基（Ser15、Ser17、Ser18、Ser19和Ser35，前4 個(gè)Ser殘基形成磷酸化中心）磷酸化后的分子質(zhì)量為24.0 kDa，非磷酸化β-酪蛋白的等電點(diǎn)為5.1，由于磷酸化，其等電點(diǎn)會(huì)降至4.7以下[3]。

β-酪蛋白在所有酪蛋白中疏水性最強(qiáng)，這是由于它含有不帶電荷且具有強(qiáng)疏水性的C端以及攜帶負(fù)電荷磷酸化絲氨酸簇的N端。β-酪蛋白在乳液中形成膠粒狀物質(zhì)，并能與磷離子、鈣離子形成穩(wěn)定的微膠粒結(jié)構(gòu)，因此可以提高乳中的鈣、磷含量。β-酪蛋白具有較強(qiáng)的雙親性，其N端殘基1～40帶有β-酪蛋白分子的全部?jī)綦姾?，疏水性低，僅含有2 個(gè)脯氨酸殘基，中間段，即殘基41～135，所帶電荷少，疏水性中等，而C端殘基136～209含有許多非極性殘基，所帶電荷少，疏水性高[2]。牛乳β-酪蛋白（A2型）的帶電荷氨基酸殘基分布如圖1所示，氨基酸組成如圖2所示。

圖1 牛乳β-酪蛋白（A2型）帶電荷氨基酸殘基分布[2]Fig. 1 Distribution of charged amino acid residues in cow milk β-casein (type A2)[2]

圖2 牛乳β-酪蛋白（A2型）氨基酸組成[2]Fig. 2 Amino acid sequence of cow milk β-casein (type A2)[2]

與牛乳β-酪蛋白分子不同，人乳β-酪蛋白含有226 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為25.38 kDa[4]。人乳β-酪蛋白是具有多種磷酸化形式的分子，每個(gè)不同磷酸化形式的β-酪蛋白分子所含的有機(jī)磷酸基團(tuán)最少為0 個(gè)，最多為5 個(gè)，其中雙磷酸化β-酪蛋白約占人乳β-酪蛋白總量的30%，是主要成分之一，因此，雙磷酸化β-酪蛋白的性質(zhì)和締合方式是人乳β-酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)和功能的重要決定因素[5]。人乳β-酪蛋白的氨基酸組成如圖3所示。

圖3 人乳β-酪蛋白的氨基酸組成[6]Fig. 3 Amino acid sequence of human milk β-casein[6]

由于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及氨基酸組成差異，酪蛋白存在多種變體，β-酪蛋白是其中重要的一種，而β-酪蛋白本身也具有多種亞型結(jié)構(gòu)[7]。根據(jù)β-酪蛋白分子結(jié)構(gòu)中相應(yīng)位置上氨基酸的變化，可以確定每種β-酪蛋白的亞型；目前已發(fā)現(xiàn)牛乳β-酪蛋白分子具有13 種亞型結(jié)構(gòu)，包括A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H1、H2及I型，其中最為常見的亞型結(jié)構(gòu)是A1型和A2型（二者為一對(duì)共顯性等位基因），其次為B型，其他類型則較少見；以A2型作為初始型或原始型，可以比較其他類型與A2型的差異：A1型是A2型氨基酸鏈67位由Pro變?yōu)镠is；A3型是106位由His變?yōu)镚ln；B型是67位由Pro變?yōu)镠is，122位由Ser變?yōu)锳rg；C型是37位由Glu變?yōu)長(zhǎng)ys，67位由Pro變?yōu)镠is；D型是18位由Ser變?yōu)長(zhǎng)ys；E型是36位由Glu變?yōu)長(zhǎng)ys；F型是67位由Pro變?yōu)镠is，152位由Pro變?yōu)長(zhǎng)eu；G型是67位由Pro變?yōu)镠is，137或138位由Pro變?yōu)長(zhǎng)eu；H1型是25位由Arg變?yōu)镃ys，88位由Leu變?yōu)镮le；H2型是72位由Gln變?yōu)镚lu，93位由Met變?yōu)長(zhǎng)eu，114位與169位間的Gln變?yōu)镚lu；I型是93位由Met變?yōu)長(zhǎng)eu[8]。牛乳β-酪蛋白亞型結(jié)構(gòu)通常是A1或A2型，2 種β-酪蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖及酶解位點(diǎn)如圖4所示[9]。A1型和A2型牛乳β-酪蛋白酶解時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有不同生理功能的肽段，它們對(duì)人類健康的作用還存在爭(zhēng)議[10]。人乳β-酪蛋白的亞型結(jié)構(gòu)較少，目前僅發(fā)現(xiàn)存在A1、A2和B型[11]。

圖4 A1、A2型牛乳β-酪蛋白結(jié)構(gòu)示意圖及酶解位點(diǎn)[9]Fig. 4 Protein chains of cow milk β-casein variants type A1, A2 and their enzymatic cleavage sites[9]

1.2 β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)

β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)對(duì)其生物活性非常重要。β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要包含4 種類型，即α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。目前已有較多關(guān)于牛乳β-酪蛋白空間結(jié)構(gòu)的研究成果。β-酪蛋白可能是一種“預(yù)熔融球狀”蛋白，在乳汁中以膠束形式存在，具有一定的自我締合能力，且在自締合前可以進(jìn)行折疊[12]。β-酪蛋白具有分子伴侶樣特性，它不僅參與酪蛋白膠束的形成，而且自身也能形成寡聚膠束[13-14]。β-酪蛋白膠束及二級(jí)結(jié)構(gòu)受溫度和溶劑的影響[15-16]，在低溫（＜10～15 ℃）條件下，β-酪蛋白單體占主導(dǎo)地位，但隨著溫度的升高，β-酪蛋白單體通過疏水鍵結(jié)合形成β-酪蛋白膠束[17]。β-酪蛋白不同亞型之間所形成的膠束形式也有差異，例如，A2型β-酪蛋白形成的膠束比A1型小，二者膠束結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致A2型β-酪蛋白的分子伴侶活性比A1型高[18]。β-酪蛋白單體和聚合物模型示意圖如圖5所示。從基于氨基酸組成序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中可以得到β-酪蛋白的三維分子模型（圖6）[19]，在向外延伸的C末端區(qū)域β-酪蛋白可以自由地與其他β-酪蛋白相互作用。

圖5β-酪蛋白單體和聚合物模型示意圖（平面圖）[18]Fig. 5 Schematic of β-casein monomer and polymer model[18]

圖6β-酪蛋白的分子模型三維示意圖[19]Fig. 6 Three-dimensional schematic of molecular model of β-casein[19]

人乳β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)與牛乳β-酪蛋白存在明顯差異[20]。在溶液中，人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的分子內(nèi)外表面巰基分布、二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量均存在較大差異。

表1 人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的巰基含量及二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量比較[21]Table 1 Comparison of sulfhydryl content and secondary structure composition between human and bovine milk β-casein[21]

由表1可知，人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白分子結(jié)構(gòu)的差異主要在于巰基的暴露程度以及α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)占比的差異，這些差異決定了二者結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的不同，人乳β-酪蛋白表現(xiàn)為表面疏水性更強(qiáng)、空間構(gòu)象更松散，而牛乳β-酪蛋白則表現(xiàn)為表面疏水性較弱、空間構(gòu)象更緊密。

2β-酪蛋白的功能特性

2.1 溶解及乳化特性

β-酪蛋白的溶解性受溫度及溶液pH值影響較大。隨著pH值的變化，β-酪蛋白的溶解度呈現(xiàn)U形變化，當(dāng)pH值為2或8～10時(shí)，β-酪蛋白溶解度最高（達(dá)到80%左右），而當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)（pI 4～5）時(shí)，β-酪蛋白溶解度最低（只有10%左右）；牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白的溶解度略有不同，但隨溫度及溶液pH值的總體變化趨勢(shì)一致[22]。

β-酪蛋白的乳化特性與其溶解度有關(guān)，當(dāng)β-酪蛋白溶解度較低時(shí)（如溶液pH 4～5），其乳化性較差，當(dāng)β-酪蛋白溶解度較高時(shí)（如溶液pH值為2或8～10），其乳化性大幅增強(qiáng)[21]。β-酪蛋白的乳化特性還與其聚合度有關(guān)。利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)β-酪蛋白進(jìn)行催化聚合，可以得到β-酪蛋白的二聚體、三聚體、四聚體和多聚體，對(duì)這些交聯(lián)β-酪蛋白聚合物的乳化性能測(cè)試表明，雖然聚合后的β-酪蛋白乳化活性降低，但乳液穩(wěn)定性隨著聚合度的增加而提高[23]。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過化學(xué)修飾（如糖基化）可以改善β-酪蛋白的乳化特性。在對(duì)β-酪蛋白進(jìn)行糖基化時(shí)發(fā)現(xiàn)，多達(dá)6 個(gè)葡萄糖分子與1 個(gè)β-酪蛋白分子結(jié)合；糖基化后的β-酪蛋白比完整的β-酪蛋白產(chǎn)生更小的乳狀液滴，且形成乳液的穩(wěn)定性提高；對(duì)β-酪蛋白糖基化前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，糖基化后β-酪蛋白的螺旋度降低，葡萄糖的摻入很可能導(dǎo)致吸附在疏水性聚合物表面/水界面后由α-螺旋形成β-轉(zhuǎn)角[24]。也有研究表明，適當(dāng)?shù)拿附馓幚砜梢愿纳痞?酪蛋白的乳化特性。經(jīng)胰蛋白酶處理后，β-酪蛋白水解物在pH 4.0～7.5范圍內(nèi)的溶解度大大提高。在pH 1.5～3.5和pH 6.5～10.0范圍內(nèi)，β-酪蛋白水解液的乳化活性均高于β-酪蛋白，但其乳化穩(wěn)定性均低于原β-酪蛋白乳狀液[25]。

2.2 營(yíng)養(yǎng)功能

β-酪蛋白富含人體必需氨基酸，是重要的氨基酸來源之一。除其本身作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，β-酪蛋白在乳汁中以膠束狀態(tài)將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是不溶性礦物質(zhì)，如磷酸鈣，以一種容易攝入的懸浮液形式輸送給嬰兒，這種懸浮液滿足了嬰兒消化系統(tǒng)的特殊要求[26]。作為一種磷酸化蛋白質(zhì)，β-酪蛋白能參與礦物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，其磷酸化區(qū)域可與鈣離子結(jié)合，磷酸化程度越高，結(jié)合鈣離子的能力越強(qiáng)[27]。β-酪蛋白可促進(jìn)鈣離子、磷離子以及其他二價(jià)陽離子，如鐵離子、鋅離子的吸收，對(duì)改善鈣、鐵、鋅等元素缺乏癥狀有積極效果[28-29]。β-酪蛋白在體內(nèi)水解產(chǎn)生低分子質(zhì)量的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）后，金屬離子結(jié)合能力會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，CPPs已經(jīng)被證明可作為載體促進(jìn)腸膜對(duì)鈣、磷、硒、鐵、鋅等離子的吸收，同時(shí)對(duì)提高機(jī)體免疫功能等也具有重要作用[30]。

2.3 分子伴侶活性

有研究發(fā)現(xiàn)，β-酪蛋白具有類似分子伴侶的功能活性。β-酪蛋白能夠通過與變性底物蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物抑制胰島素、溶菌酶、醇脫氫酶和過氧化氫酶等底物蛋白的熱聚集和化學(xué)聚集，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白不僅能阻止底物蛋白的聚集，而且能溶解已經(jīng)形成的蛋白聚集體，β-酪蛋白顯示出比α-酪蛋白更高的分子伴侶樣活性，這可能是由于二者脯氨酸殘基的數(shù)量和疏水基的暴露程度不同[31]。

β-酪蛋白的天然結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)確發(fā)揮其生物學(xué)功能很重要。還原態(tài)非酶糖基化能改變?chǔ)?酪蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，當(dāng)對(duì)β-酪蛋白進(jìn)行葡萄糖修飾時(shí)，β-酪蛋白的伴侶活性會(huì)發(fā)生改變；由于乳汁本身具有較強(qiáng)的還原環(huán)境、含有大量還原糖，因此在體內(nèi)β-酪蛋白糖基化還原過程中很可能發(fā)生類似的結(jié)構(gòu)和功能改變[32]。

2.4 生物活性肽

β-酪蛋白具有優(yōu)良的消化特性，在消化過程中，磷酸化β-酪蛋白被降解成多種具有生物活性的肽段，并能夠引起行為、消化代謝、激素、免疫、神經(jīng)和營(yíng)養(yǎng)等多方面的應(yīng)答[3]。近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過消化產(chǎn)生的β-酪蛋白肽段具有抗氧化性、抗菌抑菌性及免疫調(diào)節(jié)活性等多種功能。因此β-酪蛋白可被視為具有生物活性的不同肽的前體，這些肽在工藝過程中可以通過消化或酶解從蛋白質(zhì)中釋放出來[33]。王麟艷[34]以牛乳β-酪蛋白為原料，對(duì)其進(jìn)行體外模擬消化，對(duì)獲得的消化產(chǎn)物進(jìn)行功能評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，與未經(jīng)過消化的β-酪蛋白相比，β-酪蛋白的胃蛋白酶、胰蛋白酶及復(fù)合酶消化產(chǎn)物均具有顯著的羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力和還原能力，且復(fù)合酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）消化產(chǎn)物的抗氧化能力比單酶消化產(chǎn)物的抗氧化能力強(qiáng)。β-casofein是一種乳源生物活性肽，又稱為β-酪蛋白肽（94～123），Bessette等[35]通過大鼠喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-casofein對(duì)消炎痛類藥物所致腸炎具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與保護(hù)杯狀細(xì)胞和促進(jìn)創(chuàng)面愈合有關(guān)。A1型和B型β-酪蛋白能產(chǎn)生β-酪啡肽7，β-酪啡肽7是一種重要的乳源生物活性阿片肽，可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性阿片受體激動(dòng)劑肽的生理反應(yīng)，進(jìn)而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的生長(zhǎng)[36]。

母乳中含有多種天然乳源生物活性肽，其中一類來源于β-酪蛋白的短鏈蛋白水解肽β-casomorphins，對(duì)新生嬰兒具有阿片樣作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和飽腹功能[37]。通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母乳來源的活性肽β-casein 15和β-casein 38對(duì)包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌在內(nèi)的多種常見致病菌均有明顯抑菌作用，由于新生嬰兒容易受到這些常見致病菌感染，因此β-casein 15和β-casein 38具有抗致病菌感染治療的臨床應(yīng)用價(jià)值，可應(yīng)用于預(yù)防嬰幼兒細(xì)菌感染[38-39]。母乳來源的活性肽β-casein 125能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，可能對(duì)嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用[40]。另外，還有一些來源于β-酪蛋白的活性肽被證明具有抗高血壓作用[41]。

3β-酪蛋白在嬰兒配方乳粉中的應(yīng)用

目前，在蛋白質(zhì)方面，我國(guó)的嬰幼兒配方乳粉食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》、GB 10767—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 較大嬰兒和幼兒配方食品》）僅規(guī)定了總蛋白質(zhì)含量以及乳清蛋白與酪蛋白的比例，而對(duì)蛋白質(zhì)中的其他成分沒有進(jìn)一步規(guī)定。β-酪蛋白作為母乳蛋白質(zhì)中酪蛋白的最重要組分，在模擬嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)組成方面發(fā)揮重要作用。由于牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白的組成與結(jié)構(gòu)具有較高相似性，因此向嬰兒配方乳粉中強(qiáng)化牛乳β-酪蛋白可以優(yōu)化嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)組成和氨基酸比例，提升嬰兒配方乳粉的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

β-酪蛋白或β-酪蛋白水解物可以應(yīng)用于嬰兒配方乳粉中，并具有良好的營(yíng)養(yǎng)效果[42]。van Dael等[43]在嬰兒配方乳粉中以β-酪蛋白替代酪蛋白，使嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)及氨基酸組成模擬母乳的蛋白質(zhì)及氨基酸組成，大鼠喂養(yǎng)嬰兒配方乳粉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用β-酪蛋白替代酪蛋白不會(huì)影響生長(zhǎng)期大鼠攝入蛋白質(zhì)或礦物質(zhì)生物利用度，其營(yíng)養(yǎng)效果類似于以α-乳清蛋白替代乳清蛋白，并且優(yōu)于蛋白質(zhì)來源為普通酪蛋白的配方。

現(xiàn)階段，β-酪蛋白在嬰兒配方乳粉中的應(yīng)用主要為通過添加β-酪蛋白調(diào)整配方中蛋白質(zhì)組分的比例，以達(dá)到蛋白質(zhì)組分母乳化的目的。由于母乳中不僅含有β-酪蛋白，還存在多種天然乳源生物活性肽，因此先對(duì)β-酪蛋白進(jìn)行定向酶解，以產(chǎn)生所需的生物活性肽，再對(duì)嬰兒配方乳粉進(jìn)行生物活性肽的母乳化也許是未來嬰兒配方乳粉產(chǎn)品的研發(fā)方向。

4 結(jié) 語

β-酪蛋白作為母乳中的主要酪蛋白成分，具有多種重要的生理功能。通過比較人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的結(jié)構(gòu)及特性差異，在以牛乳β-酪蛋白替代母乳β-酪蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在活性肽水平上模擬母乳組成，使嬰幼兒配方乳粉中的生物活性肽水平接近母乳，能夠進(jìn)一步滿足嬰兒對(duì)蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)的需求。